चूहे में चेहरे तंत्रिका axotomy: चोट के लिए motoneuron प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल
Summary
We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.
Abstract
इस शल्य प्रोटोकॉल का लक्ष्य stylomastoid रंध्र से अपने बाहर निकलने पर चेहरे मांसलता innervates जो चेहरे तंत्रिका, बेनकाब और या तो कट या परिधीय तंत्रिका चोट प्रेरित करने के लिए इसे कुचलने के लिए है। इस सर्जरी का लाभ इस प्रकार अन्य तंत्रिका चोट मॉडल की तुलना में एक अपेक्षाकृत हल्के शल्य परिणाम है, जिसके परिणामस्वरूप अपनी सादगी, उच्च reproducibility, और बाद में चेहरे का पक्षाघात से महत्वपूर्ण कार्यों या गतिशीलता पर प्रभाव की कमी कर रहे हैं। एक कपाल तंत्रिका चोट मॉडल का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ motoneurons motoneuron सेल शरीर के अध्ययन को सरल बनाने, पोंस में चेहरे की मोटर नाभिक में एक अपेक्षाकृत समरूप जनसंख्या में निवास करता है। क्योंकि चेहरे तंत्रिका स्फूर्तिदान के सममित प्रकृति और चेहरे मोटर नाभिक के बीच crosstalk की कमी की वजह से, आपरेशन unaxotomized ओर एक बनती आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवारत के साथ एकतरफा प्रदर्शन किया जा सकता है। विश्लेषण की एक किस्म गधे को postoperatively किया जा सकता हैइस लेख के दायरे से बाहर हैं, जिसका विवरण शारीरिक प्रतिक्रिया, एस। उदाहरण के लिए, मांसपेशी समारोह की वसूली reinnervation के लिए एक व्यवहार मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं, या motoneurons सेल अस्तित्व को मापने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, motoneurons के सही रूप में आणविक विश्लेषण के लिए लेजर microdissection का उपयोग कर लिया जा सकता है। चेहरे तंत्रिका axotomy के न्यूनतम इनवेसिव और अच्छी तरह सहन है, क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की एक विस्तृत विविधता पर उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इस सर्जरी मॉडल परिधीय तंत्रिका चोट उपचार के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चेहरे तंत्रिका चोट न केवल motoneurons की जांच के लिए एक साधन प्रदान करता है, लेकिन मध्य और परिधीय glial microenvironment, प्रतिरक्षा प्रणाली, और लक्ष्य मांसलता के भी हिमायती हैं। चेहरे तंत्रिका चोट मॉडल तंत्रिका चोट और उत्थान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है कि एक व्यापक रूप से स्वीकार परिधीय तंत्रिका चोट मॉडल है।
Introduction
कई परिधीय तंत्रिका चोट मॉडल मौजूद हैं, लेकिन motoneurons के अध्ययन के लिए बाहर खड़ा है कि एक चेहरे तंत्रिका axotomy के मॉडल है। यह भी कपाल तंत्रिका सातवीं के रूप में जाना जाता है चेहरे तंत्रिका, पोंस में निकलती है और चेहरे की अभिव्यक्ति 1,2 की मांसपेशियों innervates। इस शल्य प्रोटोकॉल में, चेहरे तंत्रिका stylomastoid रंध्र से अपने बाहर निकलने पर अवगत कराया और कटौती या कुचल या तो है। तंत्रिका चोट की गंभीरता को क्रमिक रूप से अक्षतंतु बंडलों के आसपास लपेटो कि संयोजी ऊतक परतें हैं जो एक्सोन, endoneurium, perineurium, और epineurium की intactness के आधार पर चोट differentiates जो सुंदरलैंड तीन वर्गीकरण, निम्न में वर्गीकृत किया जा सकता है। क्रश चोट (axonotmesis) में, एक्सोन कटे हैं, लेकिन perineurium और epineurium संरक्षित कर रहे हैं। बरकरार तंत्रिका म्यान एक्सोन 4,5 regrow के भीतर जो एक नाली के रूप में कार्य करता है क्योंकि चेहरे की हिम्मत कुचलने से पूरा कार्यात्मक वसूली के बारे में 11 दिनों में होता है। परदूसरी ओर, कट चोट (neurotmesis) में, axons और सभी 3 संयोजी ऊतक परतों कटे रहे हैं, और पूरे बाहर का तंत्रिका मांसलता स्फूर्तिदान बहाल करने के लिए regrow चाहिए। Epineurium के सर्जिकल पुनः कनेक्शन अक्सर तंत्रिका transection चोटों के साथ मानव रोगियों में किया जाता है, फिर भी वसूली परिणामों शायद ही कभी इष्टतम हैं। आगे के अध्ययन तंत्रिका अपने लक्ष्य को regrow करने में विफल रहता है और क्या उपचारों में सुधार लाने और पुनर्योजी प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए नियोजित किया जा सकता है समझने के लिए क्यों जरूरी है।
चेहरे तंत्रिका axotomy के मॉडल का उपयोग तंत्रिका चोट का अध्ययन करने के कई फायदे हैं। सबसे पहले, चेहरे तंत्रिका axotomy प्रक्रिया, जल्दी आसान है, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है; और चेहरे की मांसपेशियों की एवज में पक्षाघात महत्वपूर्ण कार्यों को प्रभावित नहीं करता है और अच्छी तरह से पशु द्वारा सहन किया है। इस motoneurons वीं में एक अपेक्षाकृत समरूप जनसंख्या में रहते हैं क्योंकि सरल है motoneuron सेल शरीर का अध्ययन कर एक कपाल तंत्रिका चोट मॉडल है, क्योंकिपोंस में ई चेहरे मोटर नाभिक। सात subnuclei मांसपेशियों के एक विशिष्ट समूह innervating करने के लिए प्रत्येक विशिष्ट के रूप में वहाँ की आबादी, चेहरे मोटर नाभिक के भीतर subnuclear पैटर्न के आधार पर भिन्न होता है, तो axotomy के जवाब में subnuclear मतभेद परिणाम 2,6,7 प्रभाव हो सकता है।
चेहरे तंत्रिका चोट मॉडल का एक प्रमुख लाभ तंत्रिका स्फूर्तिदान अत्यधिक सममित है और चेहरे की मोटर नाभिक 8 के बीच कोई crosstalk है क्योंकि वहाँ unaxotomized ओर एक बनती आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं। इस शल्य चिकित्सा पद्धति का उपयोग करने का एक और लाभ यह प्रत्यक्ष सीएनएस को आघात या रक्त मस्तिष्क बाधा 9 के विघटन की कमी है। ऐसे अत्यधिक खून बह रहा है और संक्रमण के रूप में जटिलताओं इस प्रक्रिया के साथ दुर्लभ हैं।
विश्लेषण की एक किस्म तंत्रिका चोट की शारीरिक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। आंख झपकी पलटा और गलमुच्छा गतिविधि की वसूली एक व्यवहार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैकार्यात्मक वसूली 10,11 के उपाय। दृढ़रोम गतिविधि की वीडियो रिकॉर्डिंग वर्तमान चेहरे तंत्रिका स्फूर्तिदान 12,13 की वसूली का पता लगाने के लिए सबसे शक्तिशाली तरीका है। इच्छामृत्यु के बाद, brainstem के histological विश्लेषण चेहरे मोटर नाभिक के भीतर motoneuron सेल शरीर पर प्रदर्शन किया जा सकता है। चेहरे की मोटर नाभिक चोट 2,6 करने के लिए प्रतिक्रियाओं का अंतर परीक्षा के लिए अनुमति देता है, सात subnuclei, कुछ चेहरे की मांसपेशियों के लिए प्रत्येक विशिष्ट में विभाजित है। चेहरे motoneurons सेल अस्तित्व यों को गिना जा सकता है, या immunohistochemistry बायोमार्कर और विशिष्ट सेल आबादी 14 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चेहरे की मोटर नाभिक सही रूप में तंत्रिका चोट 15,16 के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की आणविक विश्लेषण के लिए लेजर कब्जा का उपयोग कर microdissected जा सकता है। चेहरे तंत्रिका axotomy के प्रभावों मोटर प्रांतस्था 17,18 में विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, तंत्रिका Wallerian अध: पतन का अध्ययन करने के विच्छेदित किया जा सकता है 19 याअक्षतंतु उत्थान 20, और मांसपेशियों neuromuscular जंक्शनों 21 अध्ययन करने के लिए हटाया जा सकता है। चेहरे तंत्रिका axotomy के भी मांसलता 21, और प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया 23, साथ मध्य और परिधीय glial कोशिकाओं 22 अध्ययन लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ज्यादा चेहरे तंत्रिका axotomy के मॉडल 24 का अध्ययन करने में पूरा किया गया है हालांकि तंत्रिका क्षति के रोगियों के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या है और वर्तमान उपचार इष्टतम परिणाम का उत्पादन करने में विफल रहते हैं, क्योंकि परिधीय तंत्रिका चोट के आगे के अध्ययन के लिए आवश्यक है। इस मॉडल तंत्रिका चोट की शारीरिक प्रतिक्रिया की जांच और तंत्रिका पुनर्जनन उपचार की प्रभावशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.
Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is funded by NIH RO1 NS 40433 (K.J.J.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereo Microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass Bead Sterilizer |
Riferimenti
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