Ansiktsnerven axotomy hos möss: En modell för att studera motoneuron svar på skada
Summary
We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.
Abstract
Målet med detta kirurgiska protokollet är att exponera ansiktsnerven, vilket innerverar ansiktsmuskulaturen, vid sitt utträde ur stylomastoid foramen och antingen skära eller krossa det att inducera perifer nervskada. Fördelar med denna operation är dess enkelhet, hög reproducerbarhet, och bristen på effekt på vitala funktioner eller mobilitet från den efterföljande ansiktsförlamning, vilket resulterar i en relativt mild kirurgiska resultatet jämfört med andra modeller nervskada. En stor fördel med att använda en kranial nervskada modell är att de motoneuroner bor i en relativt homogen population för ansiktsmotor kärnan i hjärnbryggan, förenkla studien av motoneuron cellkroppar. På grund av den symmetriska karaktär ansiktsnerven innervation och bristen på överhörning mellan ansiktsmotor kärnor, kan operationen utföras ensidigt med unaxotomized sidan fungerar som en parad intern kontroll. En mängd olika analyser kan utföras postoperativt till åsnorär den fysiologiska respons, enligt vad som är utanför ramen för denna artikel. Exempelvis kan återhämtning av muskelfunktion tjäna som en beteende markör för reinnervation, eller de motoneuroner kan kvantifieras för att mäta cellöverlevnad. Dessutom kan de motoneurons noggrant tagits med laser microdissection för molekylär analys. Eftersom ansiktsnerven axotomy är minimalt invasiva och tolereras väl, kan den utnyttjas på ett brett utbud av genetiskt modifierade möss. Dessutom kan denna operation modellen användas för att analysera effektiviteten av perifer nervskada behandlingar. Ansiktsnervskada ger ett medel för att undersöka inte bara motoneurons, utan även svaren från centrala och perifera gliaceller mikromiljö, immunförsvar, och målet muskulatur. Den ansiktsnervskada modell är ett allmänt accept perifer nervskada modell som fungerar som ett kraftfullt verktyg för att studera nervskada och regenerering.
Introduction
Många perifer nervskada modeller finns, men en som utmärker sig för att studera motoneurons är ansiktsnerven axotomy modell. Ansiktsnerven, även känd som kranialnerven VII, har sitt ursprung i pons och innerverar musklerna i ansiktsuttryck 1,2. I detta kirurgiska protokoll, är ansiktsnerven exponeras vid sitt utträde ur stylomastoid foramen och antingen skära eller krossas. Svårighetsgraden av nervskada kan klassificeras efter de Sunderland 3 klassifikationer, som särskiljer den skada grundas på intactness av axoner, endoneurium, perineurium och epineurium, som är bindvävsskikt som sekventiellt lindas runt axonet buntar. I krosskada (axonotmesis), är axoner avhuggna, men perineurium och epineurium bevaras. Komplett funktionell återhämtning från ansiktsnerven krossa sker i cirka 11 dagar eftersom den intakta nerv skidan fungerar som en kanal inom vilken axoner återföds ständigt 4,5. Påandra sidan, i den skurna skada (neurotmesis) är de axoner och alla tre bindvävsskikten avskiljes, och hela den distala nerven måste regrow att återställa muskulatur innervation. Kirurgisk återanslutning av epineurium utförs ofta i mänskliga patienter med nervtransection skador, men återvinningsresultaten är sällan optimala. Ytterligare studier krävs för att förstå varför nerven inte återföds ständigt till sitt mål och vilka behandlingar kan användas för att förbättra och påskynda regenerativ process.
Det finns många fördelar med att studera nervskada med hjälp av ansiktsnerven axotomy modell. För det första är det ansiktsnerven axotomy förfarande snabbt, enkelt, och mycket reproducerbar; och den resulterande förlamning av ansiktsmusklerna inte påverkar vitala funktioner och tolereras väl av djuret. Eftersom detta är ett hjärnnervskada modell, studera motoneuron cellkroppar är förenklad eftersom motoneurons bor i en relativt homogen befolkning i the ansiktsmotorkärnan i pons. Befolkningen skiljer baseras på subnuclear mönster inom ansiktsmotorkärnan, eftersom det finns sju subnuclei varje specifik för innervating en specifik grupp av muskler, så subnukleära skillnader i svar på axotomy kan påverka resultaten 2,6,7.
En stor fördel med den ansiktsnervskada modell är att den unaxotomized sidan kan tjäna som en parad intern kontroll eftersom nerv innervation är mycket symmetrisk och det finns ingen överhörning mellan ansiktsmotorkärnorna 8. En annan fördel med att använda denna kirurgiska metod är avsaknaden av direkt trauma till CNS eller nedbrytning av blodhjärnbarriären 9. Komplikationer såsom kraftig blödning och infektion är sällsynta med detta förfarande.
En mängd olika analyser kan utföras för att bedöma den fysiologiska respons på nervskada. Återhämtningen i ögat blinkreflexen och morrhår aktivitet kan användas som ett beteendemått på funktionell återhämtning 10,11. Videoinspelning av vibrissae aktivitet är för närvarande den mest kraftfulla metod för att detektera återvinning av ansiktsnerven innervation 12,13. Efter dödshjälp, kan utföras histologisk analys av hjärnstammen på motoneuron cellkroppar i ansiktet motorkärnan. Den ansiktsmotor kärnan är indelad i sju subnuclei, varje specifik för vissa ansiktsmuskler, vilket möjliggör differentiell undersökning av svaren på skada 2,6. Facial motoneuroner kan räknas att kvantifiera cellöverlevnad, eller immunohistokemi kan användas för att identifiera biomarkörer och specifika cellpopulationer 14. Den ansiktsMotor kärnan exakt kan microdissected använder laser capture för molekylär analys av den cellulära svar på nervskada 15,16. Effekter av ansiktsnerven axotomy kan analyseras i motoriska cortex 17,18. Dessutom kan nerven dissekeras att studera Wallerian degeneration 19 ellerAxon förnyelse 20, och musklerna kan tas bort för att studera neuromuskulära korsningar 21. Den ansiktsnerven axotomy kan också användas för att studera de medföljande centrala och perifera gliaceller 22, rikta muskulatur 21, och immunsystemet 23. Även om mycket har åstadkommits i att studera ansiktsnerven axotomy modell 24, är ytterligare studier av perifer nervskada krävs eftersom nervskada är ett stort problem för patienter och aktuella behandlingar inte att ge optimala resultat. Denna modell är ett kraftfullt verktyg för att undersöka den fysiologiska respons på nervskada och analysera effektiviteten av nervregenereringsbehandlingar.
Protocol
Representative Results
Discussion
The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.
Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is funded by NIH RO1 NS 40433 (K.J.J.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereo Microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass Bead Sterilizer |
Riferimenti
- Kaufman, M., Bard, J. . The Anatomical Basis of Mouse Development. , (1999).
- Ashwell, K. The adult mouse facial nerve nucleus: morphology and musculotopic organization. Journal of Anatomy. 135, 531-538 (1982).
- Sunderland, S. A classification of peripheral nerve injuries producing loss of function. Brain : A Journal Of Neurology. 74, 491-516 (1951).
- Beahrs, T., Tanzer, L., Sanders, V. M., Jones, K. J. Functional recovery and facial motoneuron survival are influenced by immunodeficiency in crush-axotomized mice. Experimental Neurology. 221, 225-230 (2010).
- Mesnard, N. A., Haulcomb, M. M., Tanzer, L., Sanders, V., Jones, K. J. Delayed functional recovery in presymptomatic mSOD1G93A mice following facial nerve crush axotomy. Journal of Neurodegeneration & Regeneration. 4, 21-25 (2013).
- Komiyama, M., Shibata, H., Suzuki, T. Somatotopic representation of facial muscles within the facial nucleus of the mouse. A study using the retrograde horseradish peroxidase and cell degeneration techniques. Brain Behav Evol. 24, 144-151 (1984).
- Canh, M. Y., Serpe, C. J., Sanders, V., Jones, K. J. CD4(+) T cell-mediated facial motoneuron survival after injury: Distribution pattern of cell death and rescue throughout the extent of the facial motor nucleus. Journal of Neuroimmunology. 181, 93-99 (2006).
- Isokawa-Akesson, M., Komisaruk, B. Difference in projections to the lateral and medial facial nucleus: anatomically separate pathways for rhythmical vibrissa movement in rats. Exp Brain Res. 65, 385-398 (1987).
- Streit, W., Kreutzberg, G. Response of endogenous glial cells to motor neuron degeneration induced by toxic ricin. The Journal of Comparative Neurology. 268, 248-263 (1988).
- Serpe, C. J., Tetzlaff, J. E., Coers, S., Sanders, V., Jones, K. J. Functional recovery after facial nerve crush is delayed in severe combined immunodeficient mice. Brain, Behavior, And Immunity. 16, 808-812 (2002).
- Lal, D., et al. Electrical stimulation facilitates rat facial nerve recovery from a crush injury. Otolaryngology–Head And Neck Surgery. Official Journal Of American Academy Of Otolaryngology-Head And Neck Surgery. 139, 68-73 (2008).
- Tomov, T., et al. An Example of Neural Plasticity Evoked by Putative Behavioral Demand and Early Use of Vibrissal Hairs after Facial Nerve Transection. Experimental Neurology. 178, 207-218 (2002).
- Skouras, E., Angelov, D. N. Experimental studies on post-transectional facial nerve regrowth and functional recovery of paralyzed muscles of the face in rats and mice. Anatomy (International Journal of Experimental and Clinical Anatomy). 4, 1-27 (2010).
- Xin, J., et al. IL-10 within the CNS is necessary for CD4+ T cells to mediate neuroprotection). Brain, Behavior, And Immunity. 25, 820-829 (2011).
- Mesnard, N. A., Sanders, V. M., Jones, K. J. Differential gene expression in the axotomized facial motor nucleus of presymptomatic SOD1 mice. The Journal of Comparative Neurology. 519, 3488-3506 (2011).
- Mesnard, N. A., Alexander, T. D., Sanders, V. M., Jones, K. J. Use of laser microdissection in the investigation of facial motoneuron and neuropil molecular phenotypes after peripheral axotomy. Experimental Neurology. 225, 94-103 (2010).
- Franchi, G. Changes in motor representation related to facial nerve damage and regeneration in adult rats. Experimental Brain Research. 135, 53-65 (2000).
- Munera, A., Cuestas, D. M., Troncoso, J. Peripheral facial nerve lesions induce changes in the firing properties of primary motor cortex layer 5 pyramidal cells. Neuroscienze. 223, 140-151 (2012).
- Liu, L., et al. Hereditary absence of complement C5 in adult mice influences Wallerian degeneration, but not retrograde responses, following injury to peripheral nerve. Journal of the Peripheral Nervous System. 4, 123-133 (1999).
- Ferri, C., Moore, F., Bisby, M. Effects of facial nerve injury on mouse motoneurons lacking the p75 low-affinity neurotrophin receptor. Journal of Neurobiology. 34, 1-9 (1997).
- Zhou, R. Y., Xu, J., Chi, F. L., Chen, L. H., Li, S. T. Differences in sensitivity to rocuronium among orbicularis oris muscles innervated by normal or damaged facial nerves and gastrocnemius muscle innervated by somatic nerve in rats: combined morphological and functional analyses. The Laryngoscope. 122, 1831-1837 (2012).
- Jinno, S., Yamada, J. Using comparative anatomy in the axotomy model to identify distinct roles for microglia and astrocytes in synaptic stripping. Neuron Glia Biology. 7, 55-66 (2011).
- Jones, K. J., Serpe, C. J., Byram, S. C., Deboy, C. A., Sanders, V. M. Role of the immune system in the maintenance of mouse facial motoneuron viability after nerve injury. Brain, Behavior, And Immunity. 19, 12-19 (2005).
- Moran, L. B., Graeber, M. B. The facial nerve axotomy model. Brain research. Brain research. 44, 154-178 (2004).
- Council, N. R. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
- Serpe, C. J., Kohm, A. P., Huppenbauer, C. B., Sanders, V., Jones, K. J. Exacerbation of Facial Motoneuron Loss after facial nerve transection in severe combined immunodeficient (scid) mice. Neuroscienze. 19, (1999).
- Mesnard-Hoaglin, N. A., et al. SOD1(G93A) transgenic mouse CD4(+) T cells mediate neuroprotection after facial nerve axotomy when removed from a suppressive peripheral microenvironment. Brain, Behavior, And Immunity. 40, 55-60 (2014).
- Wang, H., et al. Establishment and assessment of the perinatal mouse facial nerve axotomy model via a subauricular incision approach. Experimental Biology And Medicine. 237, 1249-1255 (2012).
- Sharma, N., Moeller, C. W., Marzo, S. J., Jones, K. J., Foecking, E. M. Combinatorial treatments enhance recovery following facial nerve crush. The Laryngoscope. 120, 1523-1530 (2010).
- Lieberman, D. M., Jan, T. A., Ahmad, S. O., Most, S. P. Effects of corticosteroids on functional recovery and neuron survival after facial nerve injury in mice. Archives of Facial Plastic Surgery. 13, 117-124 (2011).
- Serpe, C. J., Coers, S., Sanders, V. M., Jones, K. J. CD4+ T, but not CD8+ or B, lymphocytes mediate facial motoneuron survival after facial nerve transection. Brain, Behavior, And Immunity. 17, 393-402 (2003).
- Haulcomb, M. M., et al. Axotomy-induced target disconnection promotes an additional death mechanism involved in motoneuron degeneration in ALS transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. , (2014).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (60), (2012).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (54), (2011).
