Gentransfectie richting Sferoïde Cellen op micropatterned Cultuur Platen voor genetisch gemodificeerde Cell Transplantation
Summary
This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.
Abstract
Om de therapeutische werkzaamheid van celtransplantatie verbeteren, transplantatie stelsel van genetisch gemodificeerde, injecteerbare sferoïden ontwikkeld. De cel sferoïden worden op een kweeksysteem op micropatterned platen bekleed met een temperatuurgevoelige polymeer. Een aantal sferoïden zijn gevormd op de platen, die overeenkomen met de celadhesie gebied van 100 urn diameter die regelmatig zijn gerangschikt in een tweedimensionale wijze, omgeven door niet-klevende gebieden die zijn bekleed met polyethyleenglycol (PEG) matrix. De sferoïden kunnen gemakkelijk worden teruggewonnen als vloeibare suspensie door verlaging van de temperatuur van de platen en hun structuur is goed onderhouden doordat deze injectienaalden met een voldoende groot kaliber (via 27 G). Genetische modificatie wordt verkregen door gen transfectie met de oorspronkelijke niet-virale gen-carrier, Polyplex nanomicelle, dat in staat is het inbrengen van genen in cellen zonder verstoring van de bolvormige structuur. Voor primary hepatocyt sferoïden getransfecteerd met luciferase-expressie gen, wordt de luciferase duurzaam verkregen in getransplanteerde dieren, samen met bewaarde hepatocytfunctie, zoals door expressie van albumine. Dit systeem kan worden toegepast op een verscheidenheid van celsoorten waaronder mesenchymale stamcellen.
Introduction
Celtransplantatie therapie is brede aandacht trok voor de behandeling van diverse hardnekkige ziekten. De activiteit en halfwaardetijd van bioactieve factoren die worden uitgescheiden door de getransplanteerde cellen zijn essentieel voor een verbeterde therapeutische werkzaamheid van celtransplantatie systeem. Genetische modificatie van de cellen voorafgaand aan transplantatie is een techniek nuttig te reguleren en te manipuleren cellulaire functies, waaronder de afscheiding van het biologisch actieve factoren. Het is ook belangrijk om een gunstige micro voor de cellen voor het vermijden celdood of verlies van cel activiteit. Driedimensionale (3D) sferoïde celkweek, waarbij cel-cel interacties goede toestand blijven, belooft daartoe bijvoorbeeld ter verbetering albumine uitscheiding van primaire hepatocyten en bevordering multi-lijn differentiatie van mesenchymale stamcellen (MSCs ) 1-7.
In deze studie werd een nieuwe combinatie stelsel spheroid cultuur en gen transfectie wordt gebruikt om te dienen als een platform voor genetisch gemodificeerde celtransplantatie. Voor het maken van bolvormige cellen, is een bolvormige cultuur systeem micropatterned kweekplaten gebruikt. Op deze platen zijn celadhesie gebied van 100 urn diameter regelmatig gerangschikt in een tweedimensionale wijze en zijn omgeven door niet-klevende gebieden bedekt door een matrix 3 PEG. Door enten een voldoende aantal cellen, worden reeksen 3D-sferoïden van 100 micrometer diameter gevormd die overeenkomt met de micropatterned kweekbed.
De sferoïden worden teruggewonnen zonder verstoring van hun 3D structuur met warmte gevoelige celcultuur platen, die waren bekleed met een temperatuurgevoelige polymeer, poly (iso-propylacrylamide) (PIPAAm) 8-10. De micropatterned architectuur is gebouwd op de warmtegevoelige platen (maat gemaakt). Door simpelweg verlagen van de temperatuur van de platen, worden de bolletjes losgemaakt van de kweek bed en dispersed in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Aldus kan een groot aantal bolvormige deeltjes met een gelijkmatige grootte van 100 urn worden verkregen in de vorm van een injecteerbare suspensie.
Figuur 1. Schematische weergave van het bolvormige kweeksysteem op een micropatterned plaat. Genetische modificatie wordt verkregen door gen transfectie met de oorspronkelijke niet-virale gen-carrier, polyplex nanomicelle. Het bestaat uit plasmide-DNA (pDNA) en polyethyleenglycol (PEG) -polycation blokcopolymeren 11. Deze hebben een karakteristieke kern-schil structuur die bestaat uit een PEG-shell en een kern van gecondenseerde pDNA, dat een veilige en effectieve gen introductie in cellen voor therapeutische doeleinden 11. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkens figuur.
Figuur 2. Structuur van de polyplex nanomicelle gevormd door het complex van nucleïnezuren en PEG-block-polykation blokcopolymeren. In deze studie, het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de bolvormige structuur niet verstoord tijdens gentransfectie door nanomicelles. Na nanomicelle gemedieerde transfectie van primaire rat hepatocyten sferoïden, verlengd transgenexpressie verkregen meer dan een maand continu albumine uitscheiding van de hepatocyten op een niveau vergelijkbaar met dat van ongetransfecteerde sferoïden 12. De transgene expressie en albumine-uitscheiding van de sferoïden ook gehandhaafd na herstel van de warmtegevoelige platen. Het is duidelijk dat nanomicelles veilig gen-introductie te vergemakkelijken zonder dat de aangeboren functies van de hepatocytes. Zo is de combinatie van bolvormige cellen gekweekt op warmtegevoelige micropatterned platen met geninbrenging behulp nanomicelles is een veelbelovend platform voor genetisch gemodificeerde celtransplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol is het essentieel om de 3D structuur van sferoïden tijdens de stappen van gen introductie en sferoïde herstel behouden. Het is essentieel om een gunstig microenvironments behouden de cellen om celdood of verlies van celactiviteit te vermijden. Bijvoorbeeld, albumine uitscheiding, een vertegenwoordiger aangeboren functie van hepatocyten, goed geconserveerd in de hepatocyten sferoïden, terwijl de hepatocyten in de conventionele monolaag kweek verliezen snel hun secretoire capaciteit enkele dagen n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We waarderen ten zeerste Dr. Takeshi Ikeya en technisch personeel in Toyo Gosei, Tokyo, Japan voor het verstrekken van temperatuurgevoelige micropatterned cultuur platen evenals wetenschappelijke adviezen. We danken ook mevrouw Satomi Ogura, mevrouw Sae Suzuki, mevrouw Asuka Miyoshi en mevrouw Katsue Morii voor technische bijstand met dierproeven. Dit werk werd financieel ondersteund in het kader van de JSPS KAKENHI Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek, het Centrum voor Innovatie (COI) Programma en de S-innovatieprogramma van de Japan Science and Technology Agency (JST), en de JSPS Core- to-Core Program, A. Advanced Research Networks.
Materials
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
