Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה
Summary
This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.
Abstract
כדי לשפר את היעילות הטיפולית של השתלת תאים, מערכת השתלה, spheroids זריקות מהונדס גנטי פותחה. Spheroids התא ערוכים מערכת תרבות על צלחות micropatterned מצופות פולימר thermosensitive. מספר spheroids נוצרים על הצלחות, מתאים לאזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר הערוך באופן קבוע באופן דו-ממדי, מוקפים באזורים שאינם דבקים שהם מצופים בפוליאתילן גליקול מטריצה (PEG). ניתן לשחזר בקלות spheroids כהשעיה נוזלית על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, והמבנה שלהם נשמר היטב על ידי עובר אותם באמצעות מחטי הזרקה עם קליבר גדול מספיק (מעל 27 G). שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex, אשר מסוגל החדרת גנים לתאים מבלי לשבש את מבנה אליפטית. לחסודspheroids hepatocyte ארי transfected עם גן להביע לוציפראז, לוציפראז מתקבל בר קיימא בבעלי חיים מושתלים, יחד עם פונקצית hepatocyte נשמר, כפי שצוין על ידי ביטוי אלבומין. מערכת זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי גזע mesenchymal.
Introduction
טיפול השתלת תאים משך תשומת לב נרחבת לטיפול במחלות שונות סוררות. הפעילות וזמן מחצית החיים של גורמים ביו המופרשים על ידי התאים המושתלים הם חיוניים ליעילות טיפולית משופרת של מערכת השתלת תאים. הנדסה גנטית של התאים לפני ההשתלה היא טכניקה מועילה להסדיר ולטפל פונקציות סלולריות, כולל ההפרשה של הגורמים ביו. כמו כן, חשוב לשמור על מייקרו-סביבה נוחה לתאים למניעת מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. תרבות תלת ממדי תא (3D) אליפטית, שבו אינטראקציות תא אל התא נשמרות היטב, מבטיחה למטרה זו, למשל, לשיפור הפרשת אלבומין מhepatocytes העיקרי וקידום בידול רב שושלת מתאי גזע mesenchymal (MSCs ) 1-7.
במחקר זה, מערכת שילוב רומן של spheroiתרבות ד וtransfection הגן משמש לשמש כפלטפורמה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. ליצירת תאי אליפטית, משמשת מערכת תרבות אליפטית על צלחות תרבות micropatterned. על צלחות אלה, אזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר ערוכים באופן קבוע באופן דו-ממדי ומוקפים באזורים שאינם דבקים המצופים על ידי מטריקס PEG 3. על ידי זריעת מספר מספיק של תאים, מערכים של spheroids 3D של 100 מיקרומטר בקוטר נוצרים מתאים למיטת תרבות micropatterned.
Spheroids הם התאוששו מבלי לשבש את המבנה שלהם 3D באמצעות צלחות תרבית תאי thermosensitive, שמצופים בפולימר thermosensitive, פולי (ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) 8-10. ארכיטקטורת micropatterned בנויה על צלחות thermosensitive (שנבנה מותאם אישית). פשוט על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, spheroids מנותק מהמיטה התרבות ולפזרד בפוספט שנאגרו מלוח (PBS). לפיכך, ניתן להשיג מספר רב של spheroids עם גודל אחיד של 100 מיקרומטר בצורה של השעיה להזרקה.
איור 1. ייצוג סכמטי של מערכת תרבות אליפטית על צלחת micropatterned. שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex. הוא מורכב מפלסמיד דנ"א (pDNA) וקופולימרים לחסום -polycation פוליאתילן גליקול (PEG) 11. יש לי אלה מבנה ליבה-קליפה אופיינית מורכב מפגז PEG וליבה פנימית של pDNA תמצית, המאפשר הקדמת גן בטוחה ויעילה לתאים למטרות טיפוליות 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תידמות של.
איור 2. מבנה של nanomicelle polyplex שהוקם על ידי המורכב של חומצות גרעין וקופולימרים לחסום PEG-הגוש-polycation. במחקר זה, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שמבנה אליפטית לא יופרע במהלך transfection גן על ידי nanomicelles. לאחר transfections תיווך nanomicelle של spheroids hepatocyte העיקרי עכברוש, ביטוי transgene ממושך מתקבל ליותר מחודש עם הפרשת אלבומין רציפה מhepatocytes ברמה דומה לזו של spheroids untransfected 12. ביטוי transgene והפרשת אלבומין מspheroids גם נשמרים לאחר התאוששות מהצלחות thermosensitive. ברור שnanomicelles יכול להקל מבוא גן בבטחה מבלי לפגוע בפונקציות המולדת של ממולחatocytes. לפיכך, שילוב של תאי אליפטית תרבותיים על צלחות micropatterned thermosensitive עם מבוא גן באמצעות nanomicelles היא פלטפורמה מבטיחה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לשמור על מבנה 3D של spheroids במהלך השלבים של מבוא גן והתאוששות אליפטית. זה חיוני כדי לשמור על מייקרו-סביבות נוחים לתאים, כדי למנוע מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. לדוגמא, הפרשת אלבומין, פונקציה מולדת נציג hepatocytes, נשמרה היטב בspheroids hepatocyte, בעוד …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים מאוד את ד"ר טאקשי Ikeya וצוות טכני בToyo Gosei, טוקיו, יפן למתן צלחות תרבות micropatterned thermosensitive כמו גם ייעוץ מדעי. כמו כן, אנו מודים לגב 'Satomi Ogura, הגב' Sae סוזוקי, הגב 'אסוקה Miyoshi והגב' Katsue Morii לקבלת סיוע טכני בניסויים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה כלכלית בחלקו על ידי JSPs KAKENHI גרנט ב- Aid למחקר מדעי, המרכז של חדשנות תכנית (COI) ותכנית חדשנות S- מהמדע והטכנולוגיה סוכנות יפן (JST), וCore- JSPs ל- Core תכנית, א רשתות מחקר מתקדם.
Materials
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
