تقييم فعالية سرطان المخدرات توعية<em> في المختبر</em> و<em> في فيفو</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
نظرا لمستوى عال من عدم التجانس والطفرات الكامنة في السرطانات البشرية، والعلاجات وكيل واحدة، أو نظم الجمع التي تستهدف نفس المسار، من المحتمل أن تفشل. ولا بد من التركيز على تثبيط الممرات التي هي المسؤولة عن المقاومة الذاتية و / أو التكيف للعلاج. حقل نشط من التحقيق هو تطوير واختبار مثبطات إصلاح الحمض النووي التي تشجع على العمل، ومنع مقاومة، وتستخدم عادة العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي. استخدمنا بروتوكول رواية لتقييم فعالية BRCA2 تثبيط كوسيلة لتوعية الخلايا السرطانية على الحمض النووي الضارة سيسبلاتين المخدرات. تم رصد استقلاب الخلية السرطانية (تحمض والتنفس) في الوقت الحقيقي لمدة 72 ساعة لتحديد فعالية العلاج على أساس كل دقيقة دقيقة. في الجمع، وأجرينا تقييما لتردد المنتشر باستخدام غشاء مشيمائي جنين الدجاج (CAM) نموذج من التسرب والغزو. هذابروتوكول يعالج بعض نقاط الضعف في يشيع استخدامها في التجارب المختبرية وأساليب الجسم الحي لتقييم نظم جديدة علاج السرطان. ويمكن استخدامه بالإضافة إلى الطرق الشائعة مثل فحوصات تكاثر الخلايا، المقايسات موت الخلايا، وفي الدراسات المجراة طعم أجنبي الفئران، للتمييز بشكل وثيق بين أهداف المرشح والوكلاء، وحدد فقط المرشحين الواعدين لمزيد من التطوير.
Introduction
اكتسبت مقاومة لاستهداف و / أو علاج السرطان السامة للخلايا هي مشكلة السريرية الهامة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل العلاج، الانتكاس، وزيادة معدل وفيات مرضى 1. ونظرا لمستوى عال من عدم التجانس في معظم الأورام، بل هو اليقين الرياضي التي ورم من عدد الخلايا عالية بما فيه الكفاية سوف تحتوي مجموعة فرعية من خلايا مقاومة للعلاج واحدة أو مجتمعة استهداف المسارات الجزيئية التي تعتمد تلك الخلايا من أجل البقاء 2،3. الخلايا السرطانية هذه يمكن تحديدها بشكل إيجابي للأثناء العلاج، مما يؤدي إلى تكرار المرض. تطوير علاجات جديدة تستهدف في الوقت نفسه آليات بقاء الخلايا السرطانية المختلفة، سواء قبل أو بعد اختيار بوساطة العلاج، وبالتالي من المهم سريريا.
وهناك مستوى عال من عدم الاستقرار الجينوم وطفرة في الجينوم الورم هو سمة الأساسية التي تميز الخلايا السرطانية من خلايا المضيف غير ورم-4. ونتيجة لذلك، ويلقون مفيدةاستراتيجية لتر إلى زيادة فعالية العلاج الكيميائي الضارة DNA ومنع تطور المقاومة لمنع بنشاط إصلاح الحمض النووي في الخلايا السرطانية 5. هذا هو الحقل النشط التحقيق ومجموعة متنوعة من الأهداف إصلاح الحمض النووي جديدة يجري استكشافها في إعداد ما قبل السريرية. وقد تم تطوير عدد من جزيء صغير أو مثبطات القائم على العقاقير من هذه الأهداف وتشهد اختبار 6-8. والهدف هو التعرف على المرشحين ما قبل السريرية الواعدة وتقييم سلامتها وفعاليتها في التجارب السريرية.
ارتفاع تكلفة التجارب السريرية ومخاطر الفشل (لمجموعة متنوعة من الأسباب بما في ذلك تقييم ما قبل السريرية دون المستوى الأمثل) هي عقبات كأداء أمام التقدم في تطوير علاجات جديدة 9. استخدام نماذج مناسبة وصارمة ما قبل السريرية لتقييم كاف الأهداف العلاجية والأدوية المرشحة الجديد قد يقلل من نسبة الفشل عالية من التجارب السريرية 10 </suP>.
بعض أساليب ما قبل السريرية تستخدم عادة لتقييم فعالية نظم جديدة مضادة للسرطان هي: أ) قياس القدرة على الحد من انتشار الخلايا السرطانية في المختبر (المقايسات تكاثر الخلايا)، ب) تخفيض الناجم عن العلاج في قدرة الخلايا السرطانية ل المستعمرات زراعة الأنسجة شكل (المقايسات تشكيل مستعمرة)، ج) تخفيض الناجم عن العلاج في النشاط الأيضي الخلايا السرطانية في المختبر (تحويل الأكسدة صبغ)، د) التي يسببها العلاج تحريض في المختبر موت الخلايا السرطانية (أفكارك، نخرية، ذاتية البلعمة، ويرتبط مع الانقسام، وغيرها) 11، وه) في الجسم الحي الحد من النمو أو الاجتثاث من الفأر والإنسان xenografts 12-14 العلاج التي يسببها.
ومن أوجه الضعف الرئيسية للفي المختبر الطرق المذكورة هو أن أيا منها لا توفر المستمر التقييم في الوقت الحقيقي لتأثير العلاجات مرشح. بدلا من ذلك، أنها توفر المعلومات فقط في المختارة، نقاط زمنية متباعدة-أثناء العلاج. وقد تضاءلت هذه القياسات القدرة على التفكير بدقة حجم وتوقيت استجابات الخلايا السرطانية. في الجسم الحي ونماذج الماوس طعم أجنبي محدودة أيضا التكلفة العالية، وطول الوقت لإكمال، وخطر دون المستوى الأمثل الجرعات والعلاج توقيت (جدولة). وبالإضافة إلى ذلك، هناك أدلة على أن نماذج القوارض طعم أجنبي هي تنبؤ محدودة من الفعالية السريرية في البشر، مقارنة مع التقييم في المختبر من ردود الخلايا السرطانية الإنسان الأساسية وخطوط الخلايا السرطانية البشرية التي أنشئت لمرشح التدخلات العلاجية 15،16.
نحن وضعت بروتوكولا تركيبة جديدة لتقييم مجموعات دواء جديد قبل سريريا، بطريقة تعالج نقاط الضعف في الإجراءات أكثر شيوعا المذكورة أعلاه. في مكان الانتشار، تشكيل مستعمرة، أو الأكسدة صبغ المقايسات التحويل، نحن تستخدم وحدة قياس التمثيل الغذائي لتحليل التصاق الخلية، والتنفس، وتحمض في الوقت الحقيقيخلال فترة العلاج كاملة 17. في وقت واحد، ونحن التحقيق في الآثار المترتبة على الجمع بين العلاج في الجسم الحي باستخدام الجنين الدجاج مشيمائي غشاء (CAM) نموذج من الغزو والانبثاث 18،19. استخدمنا هذه الأساليب لتقييم قدرة قليل النوكليوتيد العقاقير (ASO) تستهدف BRCA2 لتحفيز فعالية يشيع استخدامها سيسبلاتين المخدرات العلاج الكيميائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لتكلفة الكامنة والمخاطر المرتبطة التجارب السريرية، هناك حاجة لتطوير أفضل وأكثر صرامة منهجية اختبار ما قبل السريرية لتقييم كاف نظم العلاج المضاد للسرطان الرواية. الحالية تقنيات شائعة الاستخدام جميع نقاط الضعف المعرض التي قد تحد من قدرتها على التمييز بين الأهد?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدم هذا العمل ممكن من المنح المقدمة إلى JK من مراكز أونتاريو للتميز وصندوق أبحاث أونتاريو.
ونود أن نشكر Siddika Pardhan والدكتور بيتر فيرغسون للحصول على المساعدة الفنية أثناء التصوير.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
Riferimenti
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
