Evaluere effektiviteten af Cancer Drug Sensibilisering<em> In vitro</em> Og<em> In Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
På grund af det høje niveau af heterogenitet og mutationer forbundet med humane cancere, terapier med enkelt middel eller en kombination regimer, der er målrettet mod den samme vej, er tilbøjelige til at svigte. Der skal lægges vægt på den hæmning af veje, der er ansvarlige for indre og / eller adaptive modstand mod behandling. En aktiv inden for efterforskning er udvikling og afprøvning af DNA reparation inhibitorer, der fremmer virkningen af, og forhindre modstand mod, almindeligt anvendte kemoterapi og strålebehandling. Vi anvendte en ny protokol til at vurdere effektiviteten af BRCA2 hæmning som et middel til at sensibilisere tumorceller for DNA-ødelæggende lægemiddel cisplatin. Tumor cellestofskiftet (forsuring og respiration) blev overvåget i realtid i en periode på 72 timer for at afgrænse behandling effektivitet på et minut for minut basis. I kombination, vi foretaget en vurdering af metastatisk frekvens ved hjælp af en kylling chorioallantoisk membran (CAM) model af ekstravasation og invasion. Detteprotokol omhandler nogle af de svagheder, der almindeligvis anvendes in vitro og in vivo-metoder til at vurdere nye cancer terapi regimer. Det kan bruges som supplement til de fælles metoder såsom celleproliferationsassays, celledødsassays, og in vivo-murine xenografundersøgelser, nærmere at diskriminere blandt kandidat mål og midler, og vælg kun de mest lovende kandidater til videreudvikling.
Introduction
Erhvervet resistens til målrettede og / eller cytotoksisk behandling af kræft er et vigtigt klinisk problem, der kan føre til behandlingssvigt, tilbagefald og øget patient dødelighed 1. På grund af den høje grad af heterogenitet i de fleste tumorer, er det en matematisk sikkerhed for, at en svulst af tilstrækkelig høj celle nummer vil indeholde en delmængde af celler resistente over for enkelte eller kombinerede terapier rettet mod molekylære veje, som disse celler er afhængige for at overleve 2,3. Sådanne tumorceller kan positivt udvalgt til under behandling, hvilket fører til sygdomstilbagefald. Udvikling af nye terapier, der samtidig er målrettet forskellige cancercelleoverlevelse mekanismer, enten før eller efter behandling-medieret udvælgelse, er derfor klinisk vigtig.
Et højt genom ustabilitet og mutation i tumor genomer er en grundlæggende egenskab, som adskiller cancerceller fra ikke-tumor værtsceller 4. Derfor er en useful strategi for at øge effektiviteten af DNA-skadelige kemoterapi og for at forhindre udvikling af resistens er aktivt at hæmme DNA-reparation i tumorceller 5. Dette er en aktiv inden for undersøgelse og en række af hidtil ukendte DNA-reparation mål undersøges i en præ-kliniske omgivelser. Der er udviklet en række lille molekyle eller antisense-baserede inhibitorer af disse mål og undergår tester 6-8. Målet er at identificere de mest lovende prækliniske kandidater og vurdere deres sikkerhed og effekt i kliniske forsøg.
Den høje pris på kliniske forsøg og risikoen for fiasko (for en række forskellige årsager, herunder suboptimal præklinisk evaluering) er formidable hindringer for fremskridt i udviklingen af nye behandlingsformer 9. Brugen af hensigtsmæssige og strenge prækliniske modeller i tilstrækkelig grad vurdere nye terapeutiske mål og kandidat lægemidler kan nedsætte den høje fejlrate af kliniske forsøg 10 </sup>.
Nogle almindeligt anvendte prækliniske metoder til at vurdere effektiviteten af nye anticancer-regimer er: a) måling af evne til at reducere tumorcelleproliferation in vitro (celleproliferationsassays), b) terapi-induceret kapacitetsreduktion af tumorceller til formular vævskultur kolonier (kolonidannelse assays), c) terapi-induceret reduktion i tumorcelle metaboliske aktivitet in vitro (redox-farvestof konvertering), d) terapi-induceret induktion af in vitro tumorcelledød (apoptotisk, nekrotisk, autophagic forbundet med mitose og andre) 11, og e) in vivo terapi-induceret reduktion af vækst eller ablation af menneskelige og mus xenotransplantater 12-14.
En væsentlig svaghed ved de anførte in vitro-metoder er, at ingen af dem giver kontinuerlig real-time evaluering af effekten af kandidat behandlinger. Tværtimod, de giver oplysninger kun på udvalgte, bredt adskilte tidspunkteri løbet af behandlingen. Sådanne målinger har mindsket evne til præcist afspejler størrelsen og timingen af tumor celle respons. In vivo mus xenograftmodeller er også begrænset af høje omkostninger, lang tid at gennemføre, og risiko for suboptimal dosering og behandling timing (planlægning). Desuden er der tegn på, at gnaver xenograftmodeller er begrænsede prædiktorer for klinisk effekt hos mennesker, sammenlignet med in vitro vurdering af svarene fra primære humane tumorceller og etablerede humane tumorcellelinier til kandidatlande terapeutiske interventioner 15,16.
Vi udtænkt en ny kombination protokol til at evaluere nye lægemiddelkombinationer præ-klinisk, på en måde, der behandler de svagheder ved de mere almindelige procedurer anført ovenfor. I stedet for spredning, kolonidannelse eller redox-dye konvertering assays, vi udnyttet en stofskifte måleenhed til at analysere celleadhæsion, respiration, og forsuring i realtidunder hele behandlingsperioden 17. Samtidig undersøgte vi effekten af behandling kombination in vivo ved hjælp af en kylling chorioallantoisk membran (CAM) model for invasion og metastase 18,19. Vi anvendte disse metoder til at vurdere evnen af et antisense-oligonukleotid (ASO) målretning BRCA2 at forstærke effektiviteten af de almindeligt anvendte kemoterapeutiske lægemiddel cisplatin.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af den iboende omkostninger og risiko forbundet med kliniske forsøg, er der et behov for at udvikle bedre og mere stringent præklinisk testmetoder i tilstrækkelig grad vurdere nye antikræftmidler behandlingsregimer. Aktuelle almindeligt anvendte teknikker alle udviser svagheder, som kan begrænse deres evne til at skelne mellem potentielt lovende terapeutiske mål / agenter, og de, der kan være mindre effektiv. Vi udtænkt en protokol til at evaluere nye anti-cancer tilgange, som behandler mange af mangle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev muliggjort af tilskud til JK fra Ontario Centres of Excellence og Ontario Research Fund.
Vi vil gerne takke Siddika Pardhan og Dr. Peter Ferguson til teknisk bistand under optagelserne.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
Riferimenti
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
