Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em> In Vitro</em> En<em> In Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
Vanwege de hoge heterogeniteit en mutaties inherent in menselijke kankers, enkel middel therapieën of combinatietherapieën die dezelfde route targeten waarschijnlijk mislukken. De nadruk moet op de remming van de routes die verantwoordelijk zijn voor intrinsieke en / of adaptieve weerstand tegen therapie worden geplaatst. Een actief gebied van onderzoek is de ontwikkeling en het testen van DNA-reparatie-remmers die de actie van te bevorderen, en weerstand te voorkomen, veelgebruikte chemotherapie en radiotherapie. We gebruikten een nieuw protocol voor de doeltreffendheid van BRCA2 inhibitie evalueren middel om tumorcellen gevoelig te maken het DNA beschadigende middel cisplatine. Tumorcel metabolisme (verzuring en ademhaling) werd gecontroleerd in real-time voor een periode van 72 uur tot doeltreffendheid van de behandeling af te bakenen op een van minuut tot minuut basis. In combinatie, we een evaluatie van metastatische frequentie uitgevoerd met behulp van een kippenembryo chorioallantoïsmembraan (CAM) model van extravasatie en invasie. Ditprotocol wordt een aantal van de tekortkomingen van de gebruikelijke in vitro en in vivo methoden om nieuwe kankertherapie regimes evalueren. Het kan worden gebruikt naast gewone werkwijzen zoals celproliferatie assays, celdood assays en in vivo muis xenograft studies nader discrimineren tussen kandidaatdoelwitten en middelen en selecteren alleen de meest veelbelovende kandidaten voor verdere ontwikkeling.
Introduction
Verworven resistentie tegen doelgerichte en / of cytotoxische behandeling van kanker is een belangrijk klinisch probleem dat kan leiden tot falen van de behandeling, terugval, en verhoogde patiënt mortaliteit 1. Gezien de hoge heterogeniteit in de meeste tumoren, is een wiskundige zekerheid dat een tumor voldoende groot aantal cellen een subset van cellen resistent of gecombineerde behandelingen die moleculaire mechanismen waarop deze cellen afhankelijk zijn voor overleving 2,3 bevat. Dergelijke tumorcellen positief geselecteerd tijdens de behandeling, leidt tot terugkeer van de ziekte. Ontwikkeling van nieuwe therapieën die gelijktijdig richten op verschillende kankercellijnen overleving mechanismen voor of nabehandeling gemedieerde selectie, dus klinisch belang.
Een hoog genoom instabiliteit en mutaties in tumor genomen is een fundamenteel kenmerk dat kankercellen onderscheidt van niet-tumor- gastheercellen 4. Bijgevolg is een useful strategie om de doeltreffendheid van DNA-beschadigende chemotherapie te verhogen en om de ontwikkeling van resistentie te voorkomen is het actief remmen DNA herstel in tumorcellen 5. Dit is een actief gebied van onderzoek en een verscheidenheid van nieuwe DNA herstel doelstellingen worden onderzocht in een pre-klinische omgeving. Een aantal kleine molecuul of-antisense gebaseerde remmers van deze doelstellingen zijn ontwikkeld en ondergaan testen 6-8. Het doel is om de meest veelbelovende preklinische kandidaten hun veiligheid en de werkzaamheid in klinische studies te identificeren en te evalueren.
De hoge kosten van klinische proeven en het risico van mislukking (om verschillende redenen, waaronder suboptimale pre-klinische evaluatie) zijn formidabele obstakels voor vooruitgang in de ontwikkeling van nieuwe therapieën 9. Het gebruik van geschikte en strenge pre-klinische modellen om adequaat nieuwe therapeutische targets en kandidaat-medicijnen te evalueren kan de hoge uitvalpercentage van klinische proeven 10 verlagen </sup>.
A) inhoudsmetingen tumorcel proliferatie te verminderen in vitro (celproliferatie assays), b) reductie-induceren capaciteit van tumorcellen: Sommige veelgebruikte preklinische methoden om de doeltreffendheid van nieuwe anti-kanker regimes evalueren vorm weefselkweek kolonies (kolonievorming assays), c) reductie-induceren in tumorcellen metabole activiteit in vitro (redox-kleurstof conversie), d) therapie geïnduceerde inductie in vitro tumor celdood (apoptose, necrotische, autofagocytische, geassocieerde met mitose en anderen) 11, en e) in vivo therapie-geïnduceerde reductie van de groei of ablatie van mens en muis xenograften 12-14.
Een belangrijke tekortkoming van het vermelde in vitro werkwijzen is dat geen van hen continue real-time evaluatie van het effect van kandidaat therapieën. Integendeel, zij geven informatie alleen bij geselecteerde, ver uiteenliggende tijdstippentijdens de behandeling. Dergelijke metingen zijn afgenomen vermogen om nauwkeurig de omvang en de timing van de tumor cel responsen. In vivo muis xenotransplantaatmodellen zijn ook beperkt door de hoge kosten, de lengte van de tijd in beslag, en het risico van sub-optimale dosering en behandeling timing (scheduling). Daarnaast zijn er aanwijzingen dat knaagdier xenotransplantaatmodellen beperkt voorspellers van klinische werkzaamheid bij de mens, in vergelijking met in vitro evaluatie van de reacties van primaire humane tumorcellen en gevestigde humane tumorcellijnen kandidaat therapeutische interventies 15,16.
Wij bedachten een nieuwe combinatie protocol om nieuwe combinaties van geneesmiddelen preklinisch evalueren op een wijze die de tekortkomingen van de hierboven genoemde meer gemeenschappelijke procedures adressen. In plaats van proliferatie, kolonie vorming, of redox-dye conversie testen, hebben we gebruik gemaakt van een stofwisseling meeteenheid naar cel adhesie, ademhaling, en verzuring in real time te analyserenTijdens de gehele behandelingsperiode 17. Tegelijkertijd onderzochten we de effecten van de behandeling combinatie in vivo door een kippenembryo chorioallantoïsmembraan (CAM) model van invasie en metastase 18,19. We gebruikten deze werkwijzen het vermogen van een antisense oligonucleotide (ASO) gericht BRCA2 de doeltreffendheid van het gebruikte chemotherapeuticum cisplatin versterken evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de inherente kosten en risico klinische studies is er behoefte aan betere en meer rigoureuze pre-klinische testmethoden om nieuwe anti-kanker behandelingen gedegen evaluatie ontwikkelen. Huidige veelgebruikte technieken al vertonen zwakke punten die hun vermogen om onderscheid te maken tussen potentieel veelbelovende therapeutische doelen / middelen kunnen beperken, en degenen die minder effectief kunnen zijn. Wij bedachten een protocol om nieuwe anti-kanker benaderingen die veel van de tekortkomingen van tradit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies aan JK uit de Ontario Centres of Excellence en het Fonds Ontario Research.
We willen graag Siddika Pardhan en Dr. Peter Ferguson bedanken voor technische bijstand tijdens het filmen.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
Riferimenti
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
