Qui, il monitoraggio in tempo reale del metabolismo delle cellule tumorali, combinato con un modello di metastasi in vivo di membrana corio-allantoica (CAM) di embrione di pollo, viene utilizzato per valutare nuovi bersagli/agenti antitumorali per la loro capacità di sensibilizzare le cellule tumorali ai chemioterapici dannosi per il DNA.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Valutare l'efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dato l'elevato livello di eterogeneità e di mutazioni inerenti tumori umani, terapie singoli agenti, o regimi di associazione che prendono di mira la stessa via, sono destinate a fallire. L'accento deve essere posto sulla inibizione di percorsi che sono responsabili per la resistenza intrinseca e / o adattabile alla terapia. Un campo di ricerca attiva è lo sviluppo e la sperimentazione di inibitori di riparazione del DNA che promuovono l'azione di, e prevenire la resistenza a, comunemente chemioterapia e la radioterapia utilizzata. Abbiamo utilizzato un nuovo protocollo per valutare l'efficacia di inibizione BRCA2 come mezzo per sensibilizzare le cellule tumorali al DNA dannoso cisplatino farmaco. Metabolismo cellulare tumorale (acidificazione e respirazione) è stata monitorata in tempo reale per un periodo di 72 ore per delineare efficacia del trattamento su un minuto da basi minuti. In combinazione, abbiamo effettuato una valutazione della frequenza metastatico con una membrana corioallantoidea embrione di pollo (CAM) il modello di stravaso e l'invasione. Questoprotocollo affronta alcuni dei punti deboli di uso comune in vitro e in vivo i metodi per valutare nuovi regimi di terapia del cancro. Può essere utilizzato in aggiunta ai metodi comuni come saggi di proliferazione cellulare, saggi di morte cellulare, e studi in vivo xenotrapianto murini, discriminare più strettamente tra target e agenti candidati, e selezionare solo i candidati più promettenti per ulteriore sviluppo.
Introduzione
Resistenza mirata e / o trattamento del cancro citotossico è un importante problema clinico che può portare al fallimento del trattamento, ricaduta acquisita, e un aumento della mortalità del paziente 1. Dato l'elevato livello di eterogeneità nella maggior parte dei tumori, è una certezza matematica che un tumore del numero sufficientemente elevato di cellule conterrà un sottoinsieme di cellule resistenti alle terapie singole o combinate rivolte vie molecolari in cui tali cellule dipendono per la sopravvivenza 2,3. Tali cellule tumorali possono essere selezionate positivamente per durante il trattamento, determinando una recidiva di malattia....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Il seguente protocollo è stato progettato per l'utilizzo con cellule aderenti. Le modifiche sono necessarie per applicare il metodo a cellule non-aderenti coltivate in sospensione. Gli esperimenti CAM descritti nel protocollo sono progettati per l'uso con cellule che esprimono un marcatore fluorescente (ad esempio, GFP, RFP, ecc). Nove giorni embrioni di pollo sono tenuti il giorno 2 del protocollo sperimentale per gli esperimenti CAM.
1. Preparazione e Trasfezione delle cellule tumorali con oligonucleotidi antisenso (ASO)
- Medio Aspirare dalla boccetta T75 (s) contenente cellule di interesse, l....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Risultati e figure adattato con il permesso di lavoro pubblicato 22.
Inibizione BRCA2 induce una diminuzione della respirazione nelle cellule tumorali trattate cisplatino
Cellule tumorali A549 polmonari umani trattati con BRCA2-targeting ASO e cisplatino esibito una diminuzione precoce e irreversibile nella respirazione, rispetto alle cellule che hanno ricevuto il controllo ASO e cisplatino da solo; dopo 24 ore di trattamento con cisplatino di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
A causa del costo inerente e rischi associati a test clinici, vi è la necessità di sviluppare una migliore e più rigorosa metodologia di test pre-clinici per valutare adeguatamente nuovi regimi di trattamento anti-cancro. Attuali tecniche comunemente utilizzate tutte debolezze mostrano che possono limitare la loro capacità di discriminare tra potenzialmente promettenti terapeutici target / agenti, e quelli che possono essere meno efficaci. Abbiamo ideato un protocollo per valutare nuovi approcci anti-tumorali che affron.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato reso possibile da finanziamenti a JK dei Centri di eccellenza dell'Ontario e del Fondo di ricerca Ontario.
Vorremmo ringraziare Siddika Pardhan e il Dr. Peter Ferguson per l'assistenza tecnica durante le riprese.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Celle A549 | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| film AeraSeal | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Oligodesossinucleotidi antisenso | Avecia | BRCA2 sequenza target: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (basi 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscopio | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH e Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatino | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Uova di gallina fecondate | Di provenienza locale | ||
| Siero fetale bovino | Gibco - Tecnologie della | ||
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen - Tecnologie per la vita | 12566014 http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html | |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Tripsina (0,25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
Riferimenti
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
