Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
Devido ao elevado nível de heterogeneidade e inerentes mutações em cancros humanos, as terapias de agente único, ou combinações de drogas que têm como alvo a mesma via, são propensos a falhar. Ênfase deve ser colocada sobre a inibição de vias, que são responsáveis pela resistência intrínseca e / ou à terapia adaptativa. Um campo ativo de investigação é o desenvolvimento e teste de inibidores de reparo de DNA que promovem a ação de, e prevenir a resistência a, comumente usado quimioterapia e radioterapia. Utilizou-se um novo protocolo para avaliar a eficácia de inibição BRCA2 como um meio para sensibilizar células tumorais ao ADN prejudiciais cisplatina droga. O metabolismo das células do tumor (acidificação e respiração) foi monitorada em tempo real por um período de 72 h, para delinear a eficácia do tratamento em um minuto a minuto. Em combinação, foi realizada uma avaliação da freqüência metastático utilizando uma membrana corioalantóide embrião de galinha (CAM) modelo de extravasamento e invasão. Esteprotocolo aborda alguns dos pontos fracos dos comumente usados in vitro e in vivo para avaliar métodos novos esquemas de terapia do câncer. Ele pode ser usado em adição aos métodos comuns, tais como ensaios de proliferação celular, ensaios de morte celular, e os estudos in vivo de xenoenxertos de murina, para discriminar entre alvos mais de perto e de agentes candidatos, e seleccionar apenas os candidatos mais promissores para posterior desenvolvimento.
Introduction
A resistência adquirida ao alvo e / ou tratamento do cancro citotóxica é um problema clínico importante que pode levar ao fracasso do tratamento, recaída, e um aumento da mortalidade do paciente. Dado o elevado grau de heterogeneidade na maioria dos tumores, é uma certeza matemática que um tumor do número de células suficientemente elevado irá conter um subconjunto de células resistentes a terapias individuais ou combinadas de segmentação vias moleculares em que as referidas células dependem para a sobrevivência 2,3. Tais células tumorais podem ser seleccionadas positivamente por durante o tratamento, levando a recorrência da doença. O desenvolvimento de novas terapias que visam simultaneamente diferentes mecanismos de sobrevivência de células de cancro, quer antes ou depois da selecção mediada por tratamento, é, portanto, clinicamente importante.
Um elevado nível de instabilidade do genoma e mutação no genoma de tumor é uma característica fundamental que distingue as células de cancro a partir de células hospedeiras não-tumorais 4. Consequentemente, uma useful estratégia para aumentar a eficácia da quimioterapia danos no DNA e para prevenir o desenvolvimento da resistência é inibir activamente a reparação do ADN em células tumorais 5. Este é um campo ativo de investigação e de uma variedade de alvos de reparo de DNA novos estão sendo exploradas em um cenário pré-clínica. Uma série de pequenas moléculas ou inibidores à base de anti-sentido de estas metas foram desenvolvidos e são submetidos a testes 6-8. O objectivo é o de identificar os candidatos pré-clínicos mais promissoras e avaliar a sua segurança e eficácia em ensaios clínicos.
O alto custo dos ensaios clínicos e o risco de falha (para uma variedade de razões, incluindo a avaliação pré-clínica sub-ótima) são formidáveis obstáculos ao progresso no desenvolvimento de novas terapias 9. A utilização de modelos adequados e rigorosos pré-clínico para avaliar adequadamente novos alvos terapêuticos e medicamentos candidatos podem diminuir a elevada taxa de insucesso de 10 ensaios clínicos </sup>.
Alguns métodos pré-clínicos comumente usados para avaliar a eficácia de novos regimes anti-cancro são: a) medição da capacidade para reduzir a proliferação de células tumorais in vitro (ensaios de proliferação celular), b) redução induzida pela terapia da capacidade de as células tumorais colónias de cultura de tecidos de forma (ensaios de formação de colónias), c) redução induzida pela terapia da actividade metabólica das células tumorais in vitro (conversão de corante redox), d) induzida por terapia de indução de morte in vitro de células de tumor (por apoptose, necrótica, autophagic, associado com a mitose e outros) 11, e e) a redução in vivo de crescimento ou ablação de xenoenxertos humanos e de rato induzida por terapia 12-14.
A principal deficiência dos métodos in vitro listados é que nenhum deles fornecer avaliação contínua em tempo real do efeito das terapias candidatos. Em vez disso, eles fornecem informações somente em pontos de tempo selecionado, amplamente separadosdurante o curso do tratamento. Tais medidas têm diminuído a capacidade para refletir com precisão a magnitude e tempo de respostas das células tumorais. In vivo modelos rato xenograft também são limitadas pelo alto custo, duração de tempo para ser concluído, e risco de dosagem e tratamento calendário abaixo do ideal (agendamento). Além disso, há evidências de que os modelos de xenoenxerto de roedor são preditores limitadas de eficácia clínica em seres humanos, em comparação com uma avaliação in vitro das respostas de células de tumores humanos primários e linhas celulares de tumores humanos estabelecidos a intervenções terapêuticas candidatos 15,16.
Eu inventei um protocolo combinação novela para avaliar novas combinações de medicamentos pré-clínica, de forma que aborda os pontos fracos dos procedimentos mais comuns listados acima. Em lugar de proliferação, a formação de colónias, ou ensaios de conversão de corante redox, utilizou-se uma unidade de medição de metabolismo para analisar a adesão celular, a respiração, a acidificação e em tempo realdurante todo o período de tratamento de 17. Simultaneamente, foram investigados os efeitos da combinação de tratamento in vivo usando um modelo de membrana corioalantóica (CAM) de invasão e metástase 18,19 embrião de galinha. Utilizou-se estes métodos para avaliar a capacidade de um oligonucleótido anti-sentido (ASO) BRCA2 direccionamento para potenciar a eficácia da cisplatina utilizada fármaco quimioterapêutico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido ao custo inerente e os riscos associados com os ensaios clínicos, existe uma necessidade de desenvolver uma melhor e mais rigorosa metodologia de ensaio pré-clínico para avaliar adequadamente a novos regimes de tratamento anti-cancro. Atuais técnicas comumente usadas todas as fraquezas de exposição que podem limitar a sua capacidade de discriminar entre alvos terapêuticos potencialmente promissoras / agentes, e aqueles que podem ser menos eficaz. Eu inventei um protocolo para avaliar novas abordagens anti-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi possível graças a subvenções a JK dos Centros de Excelência de Ontário e do Fundo de Investigação Ontario.
Gostaríamos de agradecer a Siddika Pardhan e Dr. Peter Ferguson para a assistência técnica durante as filmagens.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
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