In Utero Intrakardiella Tomat-lektin Injektioner på musembryon att Gauge renala blodflödet
Summary
This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.
Abstract
Bildandet och perfusion att utveckla njur blodkärl (bortsett från glomeruli) är kraftigt understudied. Som kärl utvecklas via angiogenes (vilket är den förgrening av av stora fartyg) och vaskulogenes (de novo kärlbildning), perfusion kartläggningstekniker såsom hartsavgjutningar, in vivo ultraljud och mikro dissektion har begränsad demonstrera intima relationer mellan dessa två processer och utvecklingsnjur strukturer inom embryot. Här beskriver vi proceduren in utero Intrakardiella ultraljud-styrda FITC-märkta tomatlektin microinjections på musembryon att mäta ontogenin av renal perfusion. Tomatlektin (TL) perfunderades hela embryot och njurar skördas. Vävnaderna samar färgas för olika njurstrukturer inklusive: nephron stamceller, nephron strukturer, ureteric epitel och kärl. Börjar på E13.5 grovkalibriga fartyg perfusion dock periferakärl förblev unperfused. Genom E15.5 och E17.5, små perifera kärl samt glomeruli började bli perfusion. Denna experimentella teknik är avgörande för att studera rollen av kärl och blodflöde under fosterutvecklingen.
Introduction
Under fosterutvecklingen två diskreta, men ändå samtidiga, vaskulära processer äger rum: angiogenes, den process genom vilken ett fartyg växer från en större befintligt kärl och vaskulogenes, vilket är en nybildning av kärl från bostäder endotel progenitorceller 1,2. Respektive, är den tidigare synonymt med blodflödet, medan den senare tros till stor del äger rum i frånvaro av den.
Samtidig till blodkärlsbildning, en cyklisk och dynamisk process av njur stamcellstransplantation syntes, proliferation och differentiering börjar utvecklas på embryonala dag 9,5 (E9.5). Vid denna punkt i ureteric knoppen (UB) invaderar dorsalt i omgivande metanefrisk mesenkym (MM), och fortsätter fram till födseln 3. Upprepade förgrening av UB in snabbt kondensera metanefrisk cap mesenkym börjar bildningen av de funktionella enheterna i njuren, nephron. Med varje ny generation av UB och Nephron, är äldre generationer förskjuts in inre kortikala och märg regioner, där de sedan genomgå ytterligare mognad och differentiering inom främst vaskulär-täta miljöer. Som framgår av Dressler et al. 3, är detta embryologisk process påskyndades av induktiv signalering, såsom överhörning mellan UB och MM, och en myriad av extracellulära faktorer 3-6. Två nyligen undersökta extracellulära faktorer inom utvecklings bukspottkörteln och njurarna inkluderar syrespänning och blodflöde 7,8. Det senare kommer att diskuteras ytterligare i detalj nedan med avseende på njurutveckling.
För att exponera den induktiva roll som blodflödet spelar potentiellt i nefronet stamceller differentiering, liksom i andra organogenesen processer, exakta metoder för embryonal blodflöde kartläggning är absolut nödvändigt.
Alternativa metoder för att mäta blodflödet inkluderar förskrivning av ultrasound avbildning och harts casts 9,10. Slutgiltigt, har dessa lägen visat sig vara inneboende saknas i deras förmåga att samtidigt presentera tidsmässiga och geografiska sammanställningar mellan blodflöde och stamcellsdifferentiering. Resin avgjutningar, till exempel, ger en giltig modell av fartyget mönstring inom vuxna vävnader, men i omogna fartyg såsom med embryonala tidpunkter, fartyg är grovt underutvecklade och läckande. Därför kastar harts misslyckas att hålla inom de små, ofta poröst, fartyg.
För dessa uppenbara hinder, bland andra, valde vi att införliva ultraljud-guidad in vivo Intrakardiella embryonala tomatlektin (TL) microinjections i våra undersökningar av njurutveckling. I detta förfarande använder vi en ultraljudssond att synkront styra en monterad mikropipett nål fylld med 2,5 ul av TL lösning in i den vänstra ventrikeln av musembryon vid E11.5, E13.5, E15.5 och E17.5 tidpunkterna. E170,5 är den senaste utvecklingsålder som nålarna är inte stark nog att penetrera mer utvecklade embryot.
Fördelarna med denna mikroinjektion metod är riklig. Ultraljud-guidad mikroinjektion möjliggör exakt positionering av en injektionsnål inom embryonala vänster kammare, passiva och kontrollerad utvisning av lösningen i att slå hjärtat av djuret, minimal skada på hjärtat och omgivande vävnader, och undvikande av plötslig hjärtsvikt och död embryo före hela kroppen perfusion. Med användning av en FITC-märkt TL, kommer varje perfusion vaskulatur bibehålla markör längs dess endotel apikala membran. I kombination med immunohistokemi, utnyttja PECAM (CD31, trombocyter endotelcellsadhesion molekyl) och diverse andra vaskulära markörer, har vi möjlighet att tydligt skilja mellan perfusion och un-perfusion fartyg, samt karakterisera något avvikande färgning av omgivande vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroinjektion anestesi och tidsram
När det gäller bedövning av mamman, är det viktigt att hålla luftflödet konstant (2-3 L / min) och vid låg PSI. Flödet av lugnande medel måste hållas vid ca 1,75-2 L / min. Samtidigt måste tidsramar där injektionerna sker noga övervakas och kontrolleras för med varje kull. För varje kull injektionsproceduren bör hållas under 45 min. Betydelsen av denna tidsfrist är avgörande för experimentet, eftersom varje embryo måste hållas inom en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5µL / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
Riferimenti
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
