Syntetisk Metode til Asymmetrisk Ferrocen Afledte Bio-konjugat systemer via Solid Phase Resin-metode

Summary

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Abstract

Tidlig påvisning er en nøgle til vellykket behandling af de fleste sygdomme, og er især afgørende for diagnosticering og behandling af mange typer af cancer. De mest almindelige teknikker anvendes, er imaging modaliteter såsom magnetisk resonans (MRI), Positron Emission Topografi (PET), og Computed Topografi (CT) og er optimale for at forstå den fysiske struktur af sygdommen, men kan kun udføres én gang hver fire til seks uger på grund af anvendelsen af ​​billeddannende midler og samlede omkostninger. Med dette i tankerne, udvikling af "point of care" teknikker, såsom biosensorer, som evaluerer den fase af sygdommen og / eller effekt af behandling i klinikerens kontor og gøre det i tide, ville revolutionere behandlingsprotokoller. ¹ Som et middel til at udforske ferrocen baseret biosensorer til påvisning af biologisk relevante molekyler ² blev metoder udviklet til at producere ferrocen-biotin bio-konjugater er beskrevet heri. Denne rapport vil fokusere på en biotin-ferrocen-cystein, der kan immobiliseres på en guld overflade.

Introduction

Biosensorer er små enheder, der anvender biomolekylær anerkendelse teknologi som platform for selektiv analyse og er brugt til deres specificitet, hastighed og lave omkostninger. Elektrokemiske biosensorer til påvisning af biomolekyler er på forkant med dette område på grund af deres enkelhed, omkostningseffektivitet og høj følsomhed. ^1,3 Den generelle anatomi af disse sensorer er en elektrode er udstyret med et genkendelsesmolekyle specifik for den biologiske markør af interesse . Binding af biomarkør af genkendelsesmolekylet resulterer i en lokal ændring af potentiale eller strøm, der kan detekteres ved simpel måling. Til dato genkendelsesgruppen kan variere fra enzymer, ^4-8 antistoffer, ^9-12 hele celler, 13-16 receptorer, ^17-20 peptider ^21-23 og DNA ²⁴ og har i høj grad fokuseret på større, biologiske molekyler. ^25-28 Forskning indsats i denne arena har koncentreret primært på immunosensorer where et immunoglobulin er immobiliseret med en redox aktiv kerne (såsom ferrocen) og anvendt til at detektere et antistof af interesse. Disse undersøgelser er blevet udelukket fra kliniske anvendelser på grund af dårlig præcision og tidsforbrug, der følger af komplikationer som følge af brug af antigen / antistoffer. ^1,3 Voksende opmærksomhed er fokuseret på påvisning af små molekyler (mindre end 1 kg / mol) biomedicinske , mad og miljømæssig interesse i tillæg til den nationale sikkerhed. ²⁹ De bedst kendte eksempler på biosensor enheder er selv-test blodsukkerapparater, som har silketryk enzymelektroder koblet til en lommeformat amperometrisk meter. Disse systemer anvender typisk en coulometrisk metode, hvor den samlede mængde ladning genereret af glucose oxidationsreaktionen er målt over en periode. Omsættelige enheder skal være bærbar, robust og håndholdt til at gøre brug letkøbt for befolkningen som helhed.

Redox tags såsom ferrocen er necessary for at give den elektrokemiske detektion af biomarkører eller små molekyler i opløsning, da de fleste biomarkører er ikke i sig selv elektrokemisk aktive. ^30-38 Ferrocen er en organometallisk molekyle, som er en gold standard for elektrokemi, hvilket gør det til et fremragende valg til integration i elektrokemiske biosensorer. Ferrocen-baserede redoxaktive arter har allerede fået betydelig opmærksomhed på grund af deres lille størrelse, god stabilitet, bekvem syntetisk adgang, let kemisk modifikation, relative lipofilicitet og let redox tuning. ^3,30-42 Små molekyler baseret på ferrocen kerne have vid udstrækning blevet anvendt som detektorer af metalioner og små molekyler. ^32-38,43 Systems rettet større arter såsom biomolekyler har udnyttet fastgørelse af store antistoffer eller immunoglobuliner til ferrocenderivater, der er indlejret på en elektrokemisk overflade. ^{1,3,39 44} I hvert tilfælde potentiale og nuværende intensiveretty af Fe ^III / Fe ^II redoxpar blev ændret ved molekylær kobling, hvorved der frembringes en ny spektroskopisk håndtag indikerer tilstedeværelsen af analytten molekyle. Denne ændring skyldes den omfattende overlapning, der opstår mellem pi-ordningen for cyclopentadienylringe og jern d-orbitaler. Hvis PI-systemet ændres, dvs. derivatiseret eller omsættes, så orbital interaktion vil til gengæld forandring. Dette vil påvirke Fe kerne og kan iagttages som et skift i potentialet i Fe ^III / Fe ^II par. ^40,45,46 Disse egenskaber gør et sådant system attraktivt for brug som en kvantificering agent i en elektrokemisk immunoassay eller biosensor.

For at fremstille ferrocen indeholdende systemer specifikke for biosensor kapacitet er det optimalt at ændre en Cp ring med bio-receptor specifik for et målmolekyle og udnytte den anden Cp ringen som en molekylær tøjr til den elektrokemiske udlæsning eller elektroden (figur 1). Syntese af disse asymmetriske ferrocenderivater udfordres af sidereaktioner og dannelsen af dimere og polymere arter dannet ved intermolekylær krydsbinding. ⁴⁷ Imidlertid koblingskemi producerer en amidbinding er den mest direkte vej til at give simple derivater af ferrocen involverer biologiske komponenter sådanne som peptider og deres metabolitter. Derfor kan fastfaseteknikker først udviklet i 1950'erne af Merrifield til peptidsyntese anvendes på organometalliske forbindelser indeholdende ferrocen. Gennem brug af ortogonalt substitueret 1'-Fmoc-amino-ferrocen-1-carboxylsyre-molekyle, et ferrocen, der kan indeholde en receptor del (biotin), elektrokemisk udlæsning (ferrocen) og immobiliserende-linker komponent (cystein) har blevet bygget og detaljeret heri. Syntesen af ​​denne bio-konjugat diskuteres samt bevis for immobilisering på en guld overflade. Dette arbejde repræsents den første præsentation af et system bestående af biotin, ferrocen og en aminosyre til immobilisering på en guld overflade.

Protocol

1. Syntese af biotin-Fc-cystein (1) Solid metoder fase til fremstilling af harpiks-bundne 1. Placer biotin indlæst harpiks (250 mg, 0,145 mmol) i en frittet sprøjte og kvælde harpiksen ved udarbejdelsen dimethylformamid (5 ml) og ryste sprøjte på en lab rysteapparat i 20 min. Udvise løsning og gentage dimethylformamid hævelse en gang til. Fjern Fmoc-beskyttelsesgruppen ved tilsætning af 4-6 ml 20% piperidin i dimethylformamid til sprøjten efterfulgt af 10-15 min ry…

Representative Results

Den harpiksbundne form 1 er vist i figur 2. Den kovalente binding af ferrocen komponent giver anledning til en orange farve til harpiksperlerne, der er persistent med kontinuerlig vask og tegn på en immobiliseret jernholdige kompleks i modsætning til jernoptagelsen af PEG komponent harpiksperlen. Den harpiks-frie form af 1 er identisk i farve til harpiksperlerne. Efter fjernelse af forbindelsen fra harpiksen-beads, renhed og udbytte (68%) som følge af de metoder, er …

Discussion

Syntesen af ​​asymmetriske ferrocenderivater er udfordrende i opløsning. For eksempel forsøg på at fremstille 1 i opløsning resulterede i lave udbytter af det ønskede produkt (mindre end 20%). Ligeledes reaktioner anvender 1'-amino-ferrocenderivater carboxylsyre (sans Fmoc) og harpiks bundet biotin resulterede i uopløseligt produkt i overensstemmelse med det polymeriserede produkt rapporteret af Baristic et al. og minimal produkt. ⁴⁷ Dette kompliceres yderliger…

Materials

Biotin Novatag Resin	NovaBiochem	8550510001
TORVIQ 10ML LUER LOCK FRITTED SYRINGE	Fisher	NC9299151
piperdine	Acros	P/3520/PB05
ninhydrin test	Sigma-Aldrich	60017-1ea
1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid	Omm Scientific	Special Order
1-​Hydroxybenzotriazole hydrate	Sigma-Aldrich	157260-25G
N,N′-Diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407-5G
N,N-​Diisopropylethylamine	Sigma-Aldrich	496219-100ML
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Novabiochem	8520080025
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T5408
1,2-ethanedithiol	Sigma-Aldrich	2930
triisopropyl silane	Sigma-Aldrich	233781
Eppendorf tubes (20 mL)	any source
methanol	any source		dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dichloromethane	any source		dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dimethylformamide	any source		dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
centrifuge	any source