los<em> En Ovo</em> Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo como un modelo de xenoinjerto eficiente de carcinoma hepatocelular
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
La membrana corioalantoidea de pollo (CAM) comienza a desarrollarse el día 7 después de la fecundación y madura por día 12. El CAM es naturalmente inmunodeficientes y altamente vascularizado, por lo que es un sistema ideal para la implantación del tumor. Además, la CAM contiene proteínas de matriz extracelular tales como fibronectina, laminina, colágeno, la integrina alfa (v) beta3, y MMP-2, por lo que es un modelo atractivo para estudiar la invasión tumoral y la metástasis. Los científicos han tardado mucho provecho de la fisiología de la CAM utilizando como modelo de la angiogénesis. Más recientemente, el ensayo de CAM se ha modificado para que funcione como un sistema modelo de xenoinjerto in vivo para varios tipos de cáncer que sirve de puente entre el trabajo básico in vitro y modelos animales de cáncer más complejos. El ensayo de CAM permite el estudio del crecimiento del tumor, las terapias anti-tumorales, y pro-tumorales vías moleculares en un sistema biológicamente relevante que es a la vez en tiempo y costo efectiva. Aquí se describe el desarrollo de la CAM xenograft modelo de carcinoma hepatocelular (HCC) con tasas de supervivencia de embriones de hasta 93% y tumor fiable tomar conduce al crecimiento de los tumores en tres dimensiones, vascularizados.
Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC) es la 3ª causa de mortalidad por cáncer en el mundo 1. Actualmente sólo el 30% de los pacientes con HCC son elegibles para los tratamientos quirúrgicos potencialmente curativos 2, y la quimioterapia sistémica no es eficaz 3. Por lo tanto, hay una necesidad apremiante insatisfecha clínico para nuevas terapias HCC, y el desarrollo de sistemas de modelos adecuados para la prueba eficiente de nuevos agentes. La membrana corioalantoidea (CAM) de ensayo polluelo proporciona un método reproducible y rentable, y rápido rendimiento medio de probar posibles fármacos anti-tumorales in vivo.
El ensayo de CAM se ha utilizado ampliamente para estudiar la angiogénesis 4. También se ha desarrollado con éxito en un modelo de xenoinjerto de tumor de cánceres, incluyendo glioblastoma 5, el cáncer de páncreas 6, melanoma 7-9, y osteosarcoma 10-11. Tanto in ovo 12 y ex ovo13 técnicas se han utilizado en la literatura, con detalles que varían de un protocolo a otro. Un gran desafío para el modelo de xenoinjerto CAM es la relativamente alta incidencia de muerte embrionaria después de la manipulación del huevo, con tasas de mortalidad de embriones de pollo publicados que van desde 25 hasta 50 por ciento de 11 a 14.
En este artículo se describe el desarrollo de un modelo de xenoinjerto in ovo de CHC que produce de forma fiable el crecimiento de tumores vascularizados tridimensionales que histológicamente se asemejan a HCC indiferenciado. Hemos adaptado un protocolo descrito por primera Ossowski et. Al 14 y han logrado de embriones de pollo tasas de supervivencia de hasta el 93% con extremadamente alta injerto tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios pasos clave en este protocolo muy probablemente explican la mejora de la supervivencia embrionaria, así como una mayor fiabilidad de crecimiento del tumor. Dejar caer la CAM alejado de la cáscara aplicando succión a la bolsa de aire es menos invasivo que otros métodos existentes (utilizando una aguja para extraer la albúmina del huevo, disección roma, etc.). El uso de un alfiler estéril para crear los dos pequeños agujeros necesarios para este método es la parte más difícil del protocolo. El uso de una…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
Riferimenti
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
