De<em> In Ovo</em> Chick chorioallantoïsmembraan (CAM) Assay als een efficiënte xenotransplantaatmodel van Hepatocellular Carcinoom
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
De chick chorion-membraan (CAM) begint te ontwikkelen op dag 7 na de bevruchting en rijpt op dag 12. De cam is natuurlijk immunodeficiënte en sterk doorbloed, waardoor het een ideaal systeem voor tumor implantatie. Voorts bevat de CAM extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, laminine, collageen, integrine alfa (v) beta3 en MMP-2, waardoor het een aantrekkelijk model voor tumor invasie en metastase te onderzoeken. Wetenschappers hebben lang gebruik gemaakt van de fysiologie van de CAM door het te gebruiken als een model van angiogenese. Meer recent heeft de CAM-assay aangepast om te werken als een in vivo xenograft model voor verschillende kankers die de kloof tussen basic di vitro werk en complexere dierlijke modellen van kanker overbrugt. De CAM-assay maakt de studie van tumorgroei, antitumor therapieën en pro-tumor moleculaire pathways in een biologisch systeem waarin zowel kosten- en tijd-effectief. We beschrijven hier de ontwikkeling van de CAM xenograft model van hepatocellulair carcinoom (HCC) embryonale overleving tot 93% en betrouwbare tumor nemen leidt tot groei van driedimensionale, gevasculariseerde tumoren.
Introduction
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de 3 belangrijkste oorzaak van kankersterfte ter wereld 1. Nog slechts 30% van de HCC patiënten komen in aanmerking voor curatieve chirurgische behandelingen 2 en systemische chemotherapie niet effectief 3. Daarom is er dringend onvervulde medische behoefte aan nieuwe therapieën HCC en de ontwikkeling van modelsystemen geschikt voor het efficiënt testen van nieuwe middelen. De chick chorion-membraan (CAM) assay levert een reproduceerbare, rendabele en snelle middellange-throughput werkwijze voor het testen van potentiële anti-tumor drugs di vivo.
De CAM-assay is uitgebreid toegepast om angiogenese te bestuderen 4. Het is ook met succes ontwikkeld tot een tumor xenograft model van kanker, zoals glioblastoom 5, 6 pancreaskanker, melanoom 09/07, 11/10 en osteosarcoom. Zowel di ovo 12 en ex ovo13 technieken zijn toegepast in de literatuur met gegevens variërend van protocol protocol. Een belangrijke uitdaging voor de CAM xenotransplantaatmodel is de relatief hoge incidentie van embryonale sterfte na manipulatie van het ei, met gepubliceerde kippenembryo sterftecijfers variërend 25-50 procent 11-14.
In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een in ovo xenotransplantaatmodel van HCC die betrouwbaar produceert groei van drie-dimensionale, gevasculariseerde tumoren die histologisch lijken ongedifferentieerde HCC. We hebben een protocol voor het eerst beschreven door Ossowski et al. 14 aangepast en chick embryonale overleving tot 93% met een extreem hoge tumor implantatie hebben bereikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een aantal belangrijke stappen in dit protocol waarschijnlijk goed voor de verbeterde embryo overleving evenals verhoogde betrouwbaarheid van tumorgroei. Laten vallen van de CAM uit de buurt van de schaal door te zuigen aan de luchtzak is minder invasief dan andere bestaande methoden (met behulp van een naald aan albumine uit het ei, stompe dissectie, enz. Te verwijderen). Met behulp van een steriele punaise op de twee kleine gaten vereist voor deze methode te maken is de meest uitdagende deel van het protocol. Het gebr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
Riferimenti
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
