Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации
Summary
Здесь мы приводим протокол постоянно количественно клеточной адгезии и де-адгезионные процессы с высоким временным разрешением в неинвазивным способом импедансными клеток-субстрат и изображений живых клеток анализов. Эти подходы выявить динамику клеточной адгезии / де адгезии процессов, вызванных модификацией матрицы и их временных отношений к адгезии зависит от сигнальных событий.
Abstract
Cell-матрица адгезии играет ключевую роль в контроле клеточной морфологии и сигнализации. Стимулы, которые разрушают клетки-матрица адгезии (например, миелопероксидазы и другие матричные модифицирующие ферменты окислители / Наличие при воспалении) участвуют в вызове патологические изменения в клеточной функции, фенотип и жизнеспособность в ряде заболеваний. Здесь мы опишем, как сопротивление ячейки-субстрат и живые подходы изображений клетка может быть легко использована для получения точных количественных изменений в режиме реального времени в клеточной адгезии и де адгезии, вызванной модификации матрицы (с использованием эндотелиальных клеток и миелопероксидазы в патофизиологической матрицы, модифицирующие стимула) с высоким временным разрешением и в неинвазивным способом. Система сопротивление клеток подложки xCELLigence непрерывно количественно площадь клеток-матрицы адгезии путем измерения электрического импеданса на поверхности клетки с субстратом в клетках, выращенных на золотых массивов микроэлектродов. Анализ изображений в заданный промежуток времени дифферециал интерференционный контраст фильмы количественно изменения в области проекции отдельных клеток с течением времени, представляя изменения в области клеточной матрицы контакта. Оба метода точной количественной быстрые изменения в клеточной адгезии и де-адгезионных процессов. Cell-подложка сопротивление на микроэлектрод биосенсоров массивов обеспечивает платформу для измерений надежный, с высокой пропускной способностью. Изображений живых клеток анализирует обеспечить дополнительные сведения о характере и динамике морфологических изменений количественно измерения импеданса клетки с субстратом. Эти дополнительные подходы обеспечивают новые ценные знания о том, миелопероксидазы, катализируемых окислительной модификации субклеточных компонентов внеклеточного матрикса вызывает быстрые изменения в клеточной адгезии, морфологии и сигнализации в эндотелиальных клетках. Эти подходы также применимы для изучения динамики клеточной адгезии в ответ на другие матрицы, модифицирующие раздражителей и в смежных адгезивных клеток (например, эпителиальных клеток).
Introduction
Стабильные клеевые контакты между клетками и их окружающей внеклеточного матрикса необходимы для поддержания гомеостаза ткани. Например, эндотелиальной клеточной адгезии к субэндотелиального матрицы в кровеносных сосудах играет важную роль в поддержании целостности эндотелия слоя и его гомеостаза функцию в качестве регулирующего, полу-проницаемой сосудистой барьер 1. Актинового цитоскелета механически соединен с адгезивных молекул матрицы на участках клеток-матрицы адгезии и адгезионных контактов на границе ячейки матрицы играют важную роль в определении положения клеточной мембране с помощью сопротивление центрально-направленного актомиозинового растягивающие усилия. Внеклеточные стимулы, которые изменяют клетка-матрикс адгезии обязательно изменить баланс сил на границе ячейки матрицы, событие, которое быстро "почувствовал" по механо-чувствительных сигнальных белков, в результате чего в трансдукции "снаружи-внутрь сигнализации". Это перекрестные помехи ставкаWEEN клетки и окружающей их внеклеточный матрикс, играет ключевую роль в контроле формы клеток, подвижность, функцию, пролиферации и выживания 2.
Разнообразные патофизиологических процессов (эмбриональное развитие, воспаления, заживления ран и метастазирования рака) характеризуются динамической реконструкции клейкой матричных субстратов матрикс окислителей и / или ферментов 3,4. Например, клейкие субэндотелиальных матричные белки в кровеносных сосудах (например, фибронектин) участвуют в качестве основных целей для модификации или деградации при воспалительных заболеваниях человека из-за локализованного производства реактивных оксидантов (например, хлорноватистой кислоты, HOCl) на производный лейкоцитов фермента миелопероксидаза (MPO), который накапливается в субэндотелию при воспалительных сосудистых заболеваний (рис 1) 5-9. Изменения в клеточной матрицы адгезии, вызванные МПО, полученных из окислителей и других матричных изменения раздражителей ЛикЭли, играют важную роль в изменении сосудистой гомеостаза во различных патологических процессов: например, путем изменения сигнализации эндотелиальных клеток, морфологии и жизнеспособности, который, в свою очередь возмущает функцию эндотелия и целостности барьера. Тем не менее, морфологические и клеточные ответы сигнализации прикрепленных клеток на внеклеточные изменения матричных только начинают понимать.
Чтобы понять, как изменения матричные езды изменения в динамике клеточной адгезии и адгезии зависит от клеточных сигнальных путей, методы требовали, чтобы точно определить их изменения в клеточной матрицы адгезии в режиме реального времени, с высоким временным разрешением. Здесь мы опишем дополнительную сопротивление клетки с субстратом и живыми методы визуализации клеток, которые отвечают этим критериям и обеспечить платформу для количественной оценки адгезии клеток и де-адгезионные процессы в неинвазивным способом.
Мы покажем, как эти импеданс клетки с субстратом и живая соответствую изображений клетокболи могут быть легко использованы для (I) отслеживать динамику прикрепление клеток и распространения (т.е. заново клеточной адгезии) на нативных и модифицированных матричных субстратов и (II), чтобы измерить динамику клеток-матрицы отряда (т.е. де-адгезии ) по прикрепленных клеток, подвергшихся воздействию матричных изменения стимулов. Система xCELLigence клеток подложки сопротивление биосенсор обеспечивает непрерывное измерение области клеточной матрицы контакте с количественной электрического импеданса на поверхности массивов золота микроэлектродов 96-луночных и выражает эти электрические измерения импеданса, как «индекс клеток", безразмерная величина, которая в значительной степени пропорционально площади клеточной подложки контакта 10 (рисунок 2), в то же время будучи чувствительным к изменениям среднего расстояния между (изолирующего) клеточной мембраны и поверхности электрода 11. Дальнейшее увеличение значений индекса клеток достигается также при образовании плотного межклеточных контактов Тат ограничить парацеллюлярная течет ток, 11 условий, которые не преобладают в экспериментах, описанных в данном исследовании. Измерение площади проекции отдельных клеток с течением времени путем анализа изображения в заданный промежуток времени дифференциально-интерференционного контраста (DIC) фильмы обеспечивает дополнительную меру изменений в области клеточной подложки контакта и обеспечивает дополнительную информацию о точной природе и динамике морфологические изменения в количественном подходом импеданса клетки с субстратом.
В частности, мы опишем применение этих подходов для мониторинга, как МПО-перекисного окисления клеевых субэндотелиальных матричных белков (например, фибронектин) (I) снижает De Novo адгезии взвешенных эндотелиальных клеток на очищенной фибронектина и (II) вызывает клеток матрицы де -adhesion в эндотелиальных клетках с установленным сцепления на фибронектина. Выполняя сигнализации параллельной клеток анализирует более времени, используя соответствующую Biochemческие анализы (например, Вестерн-блоттинга), временные и причинно-следственные связи между адгезии / де-адгезии процессов и связанных с ними изменений в клеточных сигнальных событий в зависимости от адгезии может быть определена.
Эти подходы были использованы недавно, чтобы продемонстрировать, что внеклеточный матрикс окисления катализируется субэндотелиальных месторождений MPO вызывает быструю потерю в клетки-матрицы адгезии эндотелиальных клеток, который приводится в уже существующих актомиозин сократительных сил 9. Важно отметить, что, позволяя временную связь между изменениями как клеточной адгезии и адгезии зависимой клеточной сигнализации должны быть определены, эти подходы установлено, что МПО-индуцированной модификации матрицы и сотовой де-адгезия вызывает изменений в важных адгезии зависит от клеточных сигнальных путей, включая Src киназы -зависимой паксиллина фосфорилирования и легкой цепи миозина II фосфорилирования (рис 1) 9. Этот режим окислительно-восстановительной зависит сигнализации, инвolving активацию внутриклеточных сигнальных событий внеклеточными окислительных реакций, которые разрушают клетки-матрикс адгезии, представляет роман режим клеточной сигнализации называют "вне-в окислительно-восстановительных сигнализации" (Рисунок 1) 9.
В общем, эти комплементарной биосенсора клеток подложки сопротивление и живые клетки подходы изображений должно быть ценным в выявлении, как различные матричные модифицирующие агенты или раздражители привод изменения в динамике клеточной адгезии, морфологии и сигнализации в различных адгезивных типов клеток, подлежащих широкого спектра экспериментальные установки.
Следующий протокол описывает, как количественно оценить влияние МПО-опосредованной матрицы окисления на де Ново эндотелиальной клеточной адгезии (эксперимент 1) и эндотелиальных клеток-де-адгезии (эксперимент 2) процессов. МПО связывается жадно фибронектина и других клейких субэндотелиальных белков внеклеточного матрикса и насES перекись водорода (H 2 O 2), чтобы конвертировать ионы хлорида (Cl -) к высокой реакционной хлорирования окислителя хлорноватистой кислоты (HOCl), который реагирует на местах с этих матричных белков и нарушает их адгезионные клетки свойствами (рис 1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell-матрица адгезии и де-адгезионные процессы могут быть количественно точно в режиме реального времени с высоким временным разрешением, используя сопротивление клетки с субстратом и живого изображения клеток анализы. Эти реальном времени подходы обеспечивают большое преимущество н?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
Riferimenti
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
