Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification
Summary
Her presenterer vi en protokoll for kontinuerlig å kvantifisere celle adhesjon og adhesjons-de prosesser med høy tidsmessig oppløsning i en ikke-invasiv måte ved celle-substrat impedans og levende celle bildeanalyser. Disse tilnærmingene avsløre dynamikken i celle adhesjon / de-vedheft prosesser som utløses av matrise modifikasjon og deres tidsmessige forhold til vedheft avhengig signale hendelser.
Abstract
Celle-matrise heft spiller en sentral rolle i å kontrollere cellemorfologi og signalering. Stimuli som forstyrrer celle-matrise-adhesjon (f.eks, myeloperoksidase og andre matriks-modifiserende oksidanter / enzymer som frigjøres under inflammasjon) er involvert i å utløse patologiske forandringer i cellulær funksjon, fenotype og levedyktighet i en rekke sykdommer. Her beskriver vi hvordan celle-substrat impedans og levende celle avbildningsfremgangsmåter lett kan anvendes for nøyaktig å kvantifisere sanntids endringer i celle adhesjon og de-adhesjon indusert av matrise modifikasjon (ved bruk av endoteliale celler og myeloperoksidase som en patofysiologisk matriks-modifiserende stimulus) med høy tidsoppløsning, og i en ikke-invasiv måte. Den xCELLigence celle-substrat impedans system kvantifiserer kontinuerlig område av celle-matriksinteraksjonsprosesser, adhesjon ved å måle den elektriske impedans ved celle-substrat-grensesnitt i celler dyrket på gull microelectrode matriser. Bildeanalyse av time-lapse differential kontrast interferens filmer kvantifiserer endringer i det projiserte område av individuelle celler over tid, som representerer endringer i det området av celle-matriks kontakt. Begge teknikkene nøyaktig kvantifisere raske endringer i mobilnettet vedheft og de-vedheft prosesser. Cell-substrat impedans på microelectrode biosensor arrays gir en plattform for robust, high-throughput målinger. Live-cell imaging analyser gi flere detaljer om natur og dynamikk av de morfologiske endringene kvantifisert ved celle-substrat impedansmålinger. Disse komplementære tilnærminger gi verdifull ny innsikt i hvordan myeloperoxydase-katalysert oksidativ modifikasjon av subcellulære ekstracellulære matrikskomponenter utløser raske endringer i celle adhesjon, morfologi og signalering i endotelceller. Disse metodene er også aktuelt for å studere cellulære vedheft dynamikk i respons til andre matrisemodifiser stimuli og i beslektede adherente celler (f.eks, epiteliale celler).
Introduction
Stabile klebende kontakt mellom cellene og deres omgivende ekstracellulær matriks er nødvendig for opprettholdelse av homøostase vev. For eksempel, endotelial celleadhesjon til subendotel matriks i blodkar spiller en kritisk rolle i å opprettholde integriteten av endotelial laget og homeostatisk funksjon som et regulatorisk, semi-permeabel barriere vaskulær 1. Aktin cytoskjelettet er mekanisk koblet til den selvklebende matriks molekyler på områder av celle-matrise-adhesjon og klebekontakter på celle-matriks-grensesnitt spille en viktig rolle i å bestemme posisjonen av cellemembranen ved å motstå sentralt rettede actomyosin strekkrefter. Ekstracellulære stimuli som endrer celle-matrise-adhesjon nødvendigvis å endre balansen av krefter på celle-matriksinteraksjonsprosesser grensesnitt, en hendelse som er hurtig 'avfølt' ved mekanisk-sensitivt signaleringsproteiner, hvilket resulterer i transduksjon av "utenfor-i signale". Dette krysstale betlom celler og deres omliggende ekstracellulære matrise spiller en nøkkelrolle i å kontrollere celleform, bevegelighet, funksjon, spredning og overlevelse 2.
Forskjellige patofysiologiske prosesser (embryoutvikling, inflammasjon, sårhelbredelse og kreft metastase) er kjennetegnet ved dynamisk remodellering av klebemiddel matrikssubstrater av matrisenedbrytende oksidanter og / eller enzymer 3,4. For eksempel lim subendotelmatriksen proteiner i blodkarene (f.eks fibronektin) er implisert som viktige mål for modifisering eller nedbrytning i humane inflammatoriske sykdommer på grunn av den lokaliserte produksjon av reaktive oksidanter (f.eks, hypoklorsyre, HOCl) av leukocytt-avledede enzym myeloperoksidase (MPO), som akkumuleres i løpet av subendotel inflammatorisk vaskulær sykdom (figur 1) 5-9. Endringer i celle-matrix adhesjon indusert av MPO-avledet oksidanter og andre matrisemodifiserende stimuli er likEly å spille viktige roller i å endre vaskulær homeostase i en rekke patologiske prosesser, for eksempel, ved å forandre endotelial cellesignalisering, morfologi og levedyktighet, som i sin tur perturbs endotelial funksjon og barriereintegritet. Imidlertid er de morfologiske og cellesignale svarene av heftende celler til ekstracellulære matrise modifikasjoner bare begynner å bli forstått.
For å forstå hvordan matrise modifikasjoner drive endringer i celle adhesjon dynamikk og adhesjons-avhengige cellesignalveier, er teknikker som kreves som nøyaktig kvantifisering av endringer i celle-matrise-adhesjon i sanntid med høy tidsoppløsning. Her beskriver vi komplementær celle-substrat impedans og levende celle avbildningsteknikker som oppfyller disse kriteriene og gir en plattform for å kvantifisere celleadhesjon og de-adhesjons prosesser i en ikke-invasiv måte.
Vi viser hvordan disse celle-substrat impedans og levende celle bildebehandling hensiktssmerter kan lett anvendes for å (i) å overvåke dynamikken i celleadhesjon og spredning (dvs. de novo celleadhesjon) på native og det modifiserte matrikssubstrater, og (ii) for å måle dynamikken i celle-matriks løsgjøring (dvs. de-adhesjon ) av adherente celler eksponert for matriks-modifiserende stimuli. Den xCELLigence celle-substrat impedans biosensor system gir en kontinuerlig måling av det området av celle-matriksinteraksjonsprosesser kontakt ved å kvantifisere elektrisk impedans ved overflaten av 96-brønners gull microelectrode matriser og uttrykker disse elektriske impedansmålinger som "celleindeks", en dimensjonsløs verdi som er stort sett proporsjonal med arealet av celle-substrat kontakt 10 (figur 2), mens det også er følsomme for endringer i den gjennomsnittlige avstand mellom (isolerende) cellemembranen og elektrodeoverflaten 11. En ytterligere økning i celleindeksverdier er også oppnådd ved dannelse av tett celle-celle-kontakter that begrense paracellulære strøm flyter, 11 betingelser som ikke gjør seg gjeldende i de eksperimenter som er beskrevet i denne studien. Måling av anslått areal av individuelle celler over tid ved bildeanalyse av time-lapse differensial interferens kontrast (DIC) filmer gir en utfyllende mål på endringer i området av celle-substrat kontakt og gir mer informasjon om den nøyaktige natur og dynamikk av morfologiske endringer kvantifisert ved celle-substrat impedans tilnærming.
Nærmere bestemt beskrives anvendelsen av disse fremgangsmåter for å overvåke hvordan MPO-formidlet oksydasjon av klebe subendotel matriksproteiner (f.eks fibronektin) (i) reduserer de novo adhesjon av suspenderte endotelceller mot renset fibronectin og (ii) utløser celle-matriks de -adhesion i endotelceller med etablert vedheft på fibronektin. Ved å utføre parallell celle signale analyser over tid ved hjelp av relevant Biochemical analyser (for eksempel Western blotting), tidsmessige og årsakssammenhenger mellom adhesjon / de-vedheft prosesser og tilhørende endringer i vedheft avhengige cellesignale hendelser kan bestemmes.
Disse fremgangsmåter ble nylig anvendt for å demonstrere at ekstracellulære matriks oksidasjon katalysert av subendotel forekomster av MPO utløser et hurtig tap i celle-matrise-adhesjon av endotelceller som er drevet av pre-eksisterende actomyosin kontraktile krefter 9. Viktigere, ved at den tidsmessige forholdet mellom endringer i både celleadhesjonen og heft-avhengige celle signale å være bestemt, identifisert disse tilnærmingene som MPO-indusert matrise modifisering og cellulær de-adhesjon utløser endringer i viktige vedheft avhengige cellesignalveier inkludert Src kinase -avhengig paxillin fosforylering og myosinlettkjedefosfatase II fosforylering (figur 1) 9. Denne modusen av Redox-avhengige signalering, invOlving aktivering av intracellulære signalhendelser ved ekstracellulære oksidative reaksjoner som forstyrrer celle-matrise-adhesjon, representerer en ny modus av cellesignale betegnet "utenfor-i redoks-signalering" (figur 1) 9.
Generelt bør disse utfyllende celle-substrat impedans biosensor og levende celle avbildningsfremgangsmåter være verdifulle i å avsløre hvordan ulike matrise-modifiserende stimuli eller agenter drive endringer i celle adhesjon dynamikk, morfologi og signalering innenfor forskjellige adherente celletyper som er utsatt for en rekke eksperimentelle innstillinger.
Følgende protokoll beskriver hvordan å kvantifisere effekten av MPO-mediert matrise oksidasjon på de novo endotelceller adhesjon (Forsøk 1) og endotelceller de-adhesjon (Eksperiment 2) prosesser. MPO bindes kraftig til fibronektin og andre klebe subendotel ekstracellulære matrix proteiner og osses hydrogenperoksid (H 2 O 2) for å omdanne klorioner (Cl -) til det sterkt reaktive klorerings oksydasjonsmiddel underklorsyrling (HOCl), som reagerer lokalt med disse matriksproteiner og forstyrrer deres celle adhesive egenskaper (figur 1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celle-matrise heft og de-vedheft prosesser kan kvantifiseres presist i sanntid med høy tidsoppløsning ved hjelp av celle-substrat impedans og levende celle bildebehandling analyser. Disse sanntids tilnærminger gir en stor fordel i forhold til endepunktet analyser av celleadhesjon, noe som gir dårlig tidsmessig oppløsning. Ved nøyaktig kvantifisere raske de-vedheft svar med høy tidsoppløsning, kan disse analysene gi kritisk innsikt i hvordan morfologisk respons til matrise modifikasjoner er regulert og hvordan de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
Riferimenti
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
