إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين
Summary
الموصوفة هنا هو إجراء سريع وفعال لإعادة الوظيفية للتنقية من النوع البري والبروتين CFTR الطافرة التي تحافظ على نشاط لهذه القناة كلوريد، وهو عيب في التليف الكيسي. هروب رأس المال من يوديد proteoliposomes تشكيلها بوساطة CFTR يسمح دراسات النشاط قناة وآثار جزيئات صغيرة.
Abstract
والتليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) هو عضو لتشكيل قناة فريد من ATP ملزم كاسيت (ABC) الفصيلة من الناقلين. وقد النشاط قناة الفسفرة والنوكليوتيدات كلوريد يعتمد في كثير من الأحيان من CFTR درس في نظم خلية كاملة وكقنوات واحدة في بقع غشاء استئصاله. وقد تبين أن العديد من الطفرات المسببة للالتليف الكيسي لتغيير هذا النشاط. في حين تم نشر عدد قليل من بروتوكولات تنقية، وهي طريقة إعادة سريع أن يحتفظ النشاط القناة وطريقة مناسبة لدراسة النشاط قناة السكان في نظام تنقية تم متوفرة. يتم وصف طرق السريعة هنا لتنقية وإعادة الوظيفية للبروتين CFTR طول كامل في proteoliposomes من يعرف تركيبة الدهون التي تحتفظ النشاط كقناة هاليد المنظمة. هذه الطريقة إعادة جنبا إلى جنب مع مقايسة على أساس تدفق رواية النشاط قناة هو نظام مناسب لدراسة خصائص قناة السكان من النوع البري CFTR والمسببة للأمراض المسوخ F508del- وG551D-CFTR. على وجه التحديد، والطريقة لها فائدة في دراسة الآثار المباشرة للالفسفرة، النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة مثل potentiators ومثبطات على النشاط قناة CFTR. الطرق هي أيضا قابلة للدراسة أخرى قنوات غشاء / نواقل للركائز الأيونية.
Introduction
وبوساطة وسائل النقل كلوريد عبر الأغشية قمية من الخلايا الظهارية في مثل هذه الأنسجة كما الغدد الرئة والأمعاء والبنكرياس والعرق في المقام الأول من قبل التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، وهو ATP- وعضو التنظيم الفسفرة من ABC (ATP- ملزمة كاسيت) C فصيلة من البروتينات الغشاء (مراجعة في 1). مثل أعضاء آخرين من فصيلة ABCC، CFTR هو كبير ومتعددة تمتد من البروتين الغشاء لا يتجزأ التي تربط ATP في موقعين ملزمة النوكليوتيدات شكلت في واجهة من المجالات ملزم النوكليوتيدات لها (NBDs)، حيث أنها تمتلك النشاط أتباز متواضع في واحد الموقع. ومع ذلك، على عكس أعضاء آخرين فصيلة ABCC، تطورت CFTR كقناة الكلور المنظمة فريدة بدلا من أن يكون نقل المذاب النشط.
الطفرات في CFTR سبب التليف الكيسي، وهو مرض يصيب أجهزة متعددة بما في ذلك الرئتين والجهاز الهضمي والبنكرياس والجهاز التناسلي، مما يؤدي إلى مرضيdity والوفيات في البالغين الصغار. حسابات أمراض الرئة عادة لالوفاة المبكرة في التليف الكيسي وفي معظم الحالات الناجمة عن فقدان وظيفة CFTR على ظهارة سطح الشعب الهوائية إجراء. عدم وجود CFTR نشاط قناة كلوريد يسبب انخفاضا في كل من الكلور – وحركة المياه عبر البشرة السطحية لتعديل طبقة السائل على سطح قمية من ظهارة مهدبة الجهاز التنفسي. وهذا يؤدي في سائل لزج سطح مجرى الهواء أن يضعف من قدرة الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي مهدبة لمسببات الأمراض واضحة على نحو فعال من الشعب الهوائية. ونتيجة لذلك، فإن معظم المرضى الذين يعانون من نوبات CF المتكررة من التهاب في الرئتين وتلف الرئتين بسبب التهاب.
كما هو متوقع، ركزت دراسات لآلية عمل البروتين CFTR العادي في المقام الأول على دراسات مفصلة الكهربية من النشاط قناة النابضة به. وقد أظهرت الدراسات قناة واحدة مباشرة أن وظائف CFTR باعتباره PKA التي تعتمد على الكلور– القناة التي تمتلك بوابة للتنظيم ATP 2. وتوفر دراسات الكهربية مفصلة على قدر كبير من المعلومات عن قنوات CFTR واحدة 1،3، ولكن قد يكون هناك قلق حول ما إذا كانت الخصائص في أي قناة واحدة خاصة أن تمت دراستها هي انعكاس للسكان قنوات CFTR وبالتالي فإن قناة واحدة ينبغي النظر دائما النتائج جنبا إلى جنب مع أساليب لدراسة السكان العيانية. الفحص المباشر للنشاط قناة سكان CFTR تنقيته لديه القدرة على توفير نظرة ثاقبة على عيب الجزيئية المرتبطة الطفرات المسببة للأمراض ودفع اكتشاف جهري الكيميائية التي إصلاح البروتينات CFTR متحولة. حتى الآن، هناك ما يزيد على 1،900 طفرات مختلفة في CFTR يعتقد أن تسبب التليف الكيسي 4. الطفرة الكبرى، F508del-CFTR، وجدت على أليل واحد على الأقل في ما يقرب من 90٪ من المرضى في أمريكا الشمالية وأوروبا يؤدي إلى بروتين misfolding لالاحتفاظ الثانية في الشبكة الإندوبلازمية 5. لديها F508del-CFTR أيضا عواقب أخرى، بما في ذلك النشاط المعيبة قناة 6-9. ويرتبط غياب الناتجة من CFTR من سطح الخلية مع المرض الشديد. G551D-CFTR، طفرة أقل شيوعا، ويعتقد أن تكون مطوية بعد غير مختلة كقناة كلوريد على سطح الخلية 6 بشكل صحيح. تطوير المصححين جزيء صغير وpotentiators لديه هدف تصحيح قابلة للطي و / أو الاتجار المسوخ مثل F508del-CFTR إلى سطح الخلية، وبالتالي يؤدي إلى زيادة نشاط أو قناة من الطفرات مثل G551D عندما موجودة على سطح الخلية، على التوالي . في حين أن المصححين VX-809 وVX-661 (لا يتم بعد الموافقة عليها لاستخدامها في المرضى، وpotentiator Kalydeco (ivacaftor، VX-770) يتم استخدامه عند 150 ملغ كل 12 ساعة في المرضى الذين CF> 6 سنوات مع واحد على الأقل G551D طفرة -CFTR، ومؤخرا للمرضى مع واحدة من G178R، S549N، S549R، G551S، G1244E، S1251N، S1255PوG1349D. Kalydeco على حد سواء آمنة والنتائج في تحسين التدابير السريرية للمرض CF 10، إلا أن آلية عمل هذا الجزيء الصغير وغير مفهومة في وقت موافقة ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام في المرضى.
وقد وصفت حفنة من طرق تنقية CFTR سابقا 2،11-18، وكثير منها يتطلب فترة طويلة من الوقت لإكمال. في منشور صدر مؤخرا 19، وقد وصفت لتنقية وإعادة السريع طريقة فريدة لCFTR overexpressed في 9 خلايا S و نظام التعبير، وكان يستخدم هذا البروتين النقي في أنظمة الدهون محددة لتطوير CFTR هاليد النشاط قناة فحص لعدد سكانها CFTR الجزيئات. الفحص يلخص آثار معروفة من الفسفرة، النيوكليوتيدات ومثبطات على وظيفة CFTR. تم استخدام نظام لاستجواب آثار potentiator VX-770 / Kalydeco على Wt- (البرية من نوع)، وقد تبين F508del- وG551D-CFTR وذلك لأولالوقت أن الدواء يتفاعل مباشرة مع البروتين CFTR لتحفيز النشاط قناتها بطريقة ATP-مستقلة، مما يدل على المرافق العامة وتطبيق هذه الأساليب لدراسة تفاعل CFTR والمسوخ مع النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة من منظور السكان ل الإجابة على الأسئلة ذات الصلة سريريا عن البروتين. كما تم استخدام أساليب لدراسة الجزيئات الأخرى potentiator ومشتقاتها 20، فضلا عن الآثار المترتبة على مصحح جزيء صغير على نشاط البروتين 21.
وقد استخدمت المقايسات هروب رأس المال في العديد من الدراسات سابقا للتحقيق في نشاط المسوخ CFTR وآثار المركبات CFTR-تغييري على نشاطها، بما في ذلك المقايسات خلية كاملة باستخدام الأقطاب، استشفاف المشعة وfluorophores 22،23، الحويصلات الغشاء مع أيون أقطاب انتقائية 24 وتنقيته CFTR تشكيلها مع استشفاف المشعة 25. ومع ذلك ثوذكر استخدام (ه) من أيون أقطاب انتقائية لدراسة تنقية CFTR تشكيلها مؤخرا لأول مرة 19. وقد استخدم للتكيف من الطريقة الحالية لإعادة تشكيل وتوصيف وظيفي لاثنين من البروتينات الغشاء في الزائفة الزنجارية، الممرض CF المشترك. واستخدمت إعادة تشكيل تنقية AlgE بروتين الغشاء الخارجي إلى جانب قياسات هروب رأس المال يوديد لدعم نموذجا لإفراز الجينات أنيوني من خلال هذا نقل 26. طبقت إعادة والقياسات هروب رأس المال يوديد للبروتين Wzx النقي، والذي سمح نموذجا لأن اقترح أن يشير إلى وجود H + آلية تنادل متعاكس معتمد على لالمرتبطة الدهون قليل السكاريد النبات عبر الغشاء الداخلي للبكتيريا عن طريق هذا البروتين 27. في كلتا الحالتين كان يستخدم يوديد كبديل للالركيزة أنيوني، وإن كان أقل سرعة مما قد يتوقع المرء لالركيزة الأم. طريقة قد تكون مناسبة للتكيف مع بروتينات أخرى مع جالنقل أو التوصيل مسارات ationic لركائز الأيونية.
هنا يوصف إجراء تنقية السريع للبروتين CFTR وإعادة حيز proteoliposomes من الدهون محددة. يمكن بسهولة إجراء إعادة السريع تكون مصممة للاستخدام مع CFTR تنقيته بواسطة طرق أخرى، شريطة أن يكون نوع من المنظفات المستخدمة في تنقية هو قابل للإزالة من قبل الأساليب المستخدمة هنا أو يمكن تبادل لالمنظفات مناسب قبل إجراء إعادة. يتم وصف طريقة هروب رأس المال يوديد لقياس النشاط قناة النقي وإعادة تشكيل البروتين CFTR بالتفصيل ويتم عرض بعض النتائج النموذجية التي يمكن الحصول عليها من هذا الأسلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان هناك عدد محدود من بروتوكولات تنقية لكامل طول والوظيفية العزلة CFTR، من مجموعة متنوعة من أنظمة overexpression الخلوية. الطريقة الموصوفة هنا هو مفيد لأنه يسمح تنقية السريع لWT-CFTR أو تخصيب عال من F508del- وG551D-CFTR بكميات معتدلة غير وظيفية للغاية في المقايسات بما في ذلك أتباز والقي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
Riferimenti
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
