Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein
Summary
Beskrevet her er en hurtig og effektiv fremgangsmåte for funksjonell rekonstitusjon av renset villtype og mutant CFTR protein som bevarer aktivitet for dette klorid kanal, som er defekte i cystisk fibrose. Jodid utstrømming fra rekonstituerte proteoliposomes mediert av CFTR tillater studier av kanal aktivitet og effekter av små molekyler.
Abstract
Den Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR) er en unik kanal dannende medlem av ATP Binding Kassett (ABC) super av transportører. Kanalen aktivitet av CFTR fosforylering og nucleotide avhengig klorid er ofte studert i hele cellesystemer og som enkeltkanaler i utskårende membran patcher. Mange cystisk fibrose-forårsakende mutasjoner er blitt vist å endre denne aktivitet. Mens et lite antall renseprotokoller er blitt publisert, har en rask metode for rekonstituering som beholder kanalaktivitet, og en egnet metode for å studere kanal populasjon aktivitet i et renset system er mangelfull. Her hurtige metoder er beskrevet for rensing og funksjonell rekonstitusjon av full-lengde proteinet CFTR inn proteoliposomes med definert lipid sammensetning som beholder aktivitet som et regulert halogenid kanal. Denne tilberedning fremgangsmåte sammen med en ny fluks-baserte analysen av kanalaktivitet er et egnet system forstudere kanal befolkning egenskapene til villtype CFTR og sykdomsfremkallende mutanter F508del- og G551D-CFTR. Konkret har metoden verktøyet i å studere de direkte virkningene av fosforylering, nukleotider og små molekyler som potensiatorer og hemmere på CFTR kanal aktivitet. Metodene er også mottagelig for studiet av andre membran kanaler / transportører for anioniske underlag.
Introduction
Klorid transport over de apikale membraner av epitelceller i slike vev som lunge, tarm, bukspyttkjertel og svettekjertler er i hovedsak mediert av Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR), en ATP- og fosforylering regulert medlem av ABC (ATP- bindende kassett) C familien av membran proteiner (anmeldt i 1). I likhet med andre medlemmer av subfamilien ABCC er CFTR et stort, multi strekker seg integrert membranprotein som binder ATP ved to nukleotid-bindingsseter som dannes ved grenseflaten av de nukleotid-bindende domener (NBDs), hvor det har beskjeden ATPase-aktivitet på en enkelt nettstedet. Imidlertid, i motsetning til andre ABCC subfamilien medlemmer, har CFTR utviklet seg som en unik regulert Cl kanal i stedet for som et aktivt oppløst stoff transportør.
Mutasjoner i CFTR årsaken Cystisk fibrose, en sykdom som påvirker flere organer, inkludert lungene, fordøyelsessystem, bukspyttkjertel og skjede, som fører til morbidity og dødelighet hos unge voksne. Lungesykdom utgjør typisk for tidlig dødelighet i cystisk fibrose, og i de fleste tilfellene er forårsaket av tap av funksjons CFTR på overflaten epitelet av de ledende luftveier. Mangelen på CFTR kloridkanal-aktivitet fører til en reduksjon i både Cl – og vann bevegelse over overflaten epitel for å modifisere fluid-lag på den apikale overflate av prikk respiratorisk epitel. Dette resulterer i en viskøs luftveisoverflatevæske som svekker evnen til cilierte respiratoriske epitel-celler for effektivt å klare patogener ut av luftveiene. Som en konsekvens av de fleste CF-pasienter lider av tilbakevendende anfall av lungebetennelse og lungeskade på grunn av betennelse.
Som forventet, studier av virkningsmekanismen til den normale proteinet CFTR primært fokusert på detaljerte elektrofysiologiske studier av dens kanal gating aktivitet. Enkeltkanal studier har vist direkte at CFTR fungerer som en PKA-avhengig Cl– Kanal som besitter en ATP regulert gate 2. Detaljelektrofysiologiske studier gir en god del informasjon om enkelt CFTR kanaler 1,3, men det kan være bekymring med hensyn til om egenskapene til en bestemt enkelt kanal som har blitt studert er reflekterende av hele befolkningen i CFTR kanaler og derfor enkelt kanal Resultatene bør alltid vurderes sammen med metoder for å studere den makroskopiske befolkningen. Direkte analyse av befolkningen kanal aktivitet av renset CFTR har potensial til å gi innsikt i den molekylære defekter forbundet med sykdomsfremkallende mutasjoner, og for å drive oppdagelsen av kjemiske modulatorer som reparerer mutant CFTR proteiner. Til dags dato er det i overkant av 1900 forskjellige mutasjoner i CFTR tenkt å forårsake Cystisk fibrose 4. Den store mutasjon, F508del-CFTR, funnet på minst ett allel i ca 90% av pasientene i Nord-Amerika og Europa fører til protein misfolding ennd oppbevaring i det endoplasmatiske retikulum 5. F508del-CFTR har også andre konsekvenser, herunder defekt kanal aktivitet 6-9. Den resulterende mangel på CFTR fra celleoverflaten er assosiert med alvorlig sykdom. G551D-CFTR, en mindre vanlig mutasjon, er antatt å være riktig foldet ennå er dysfunksjonell som et klorid kanal på celleoverflaten 6. Utviklingen av småmolekylære correctors og potensiatorer har som mål å korrigere folding og / eller salg av mutanter som F508del-CFTR til celleoverflaten, og potensierende eller økende kanalaktiviteten av mutasjoner som G551D når de er tilstede på celleoverflaten, henhold . Mens correctors VX-809 og VX-661 (ennå ikke er godkjent for bruk hos pasienter, forsterkeren Kalydeco (ivacaftor, VX-770) blir brukt på 150 mg hver 12. time i CF-pasienter> 6 år med minst ett G551D -CFTR mutasjon, og mer nylig for pasienter med en av G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pog G1349D. Kalydeco er både sikker og resulterer i forbedring av de kliniske mål på sykdoms CF 10, men mekanismen for virkningen av denne lille molekylet er dårlig forstått ved tidspunktet for FDA-godkjenning for anvendelse i pasienter.
En håndfull av CFTR rensemetoder har blitt beskrevet tidligere 2,11-18, mange av dem krever en betydelig lengre tid å fullføre. I en nylig publikasjon 19, ble et unikt hurtig rensing og rekonstituering metoden beskrevet for CFTR overuttrykt i S f 9 celle-ekspresjonssystem, og dette renset protein i definert lipid-system ble benyttet for å utvikle en CFTR halogenid kanalaktivitet assay for en populasjon av CFTR molekyler. Analysen sammenfatter de kjente effektene av fosforylering, nukleotider og hemmere på CFTR funksjon. Systemet ble benyttet for å undersøke effektene av potensiator VX-770 / Kalydeco på vekt- (vill-type), F508del- og G551D-CFTR, og det ble vist for den førstetid at stoffet samhandler direkte med CFTR protein for å forsterke sin kanal aktivitet i en ATP-uavhengig måte, demonstrere nytteverdi og anvendelse av disse metodene til studiet av samspillet mellom CFTR og mutanter med nukleotider og små molekyler fra en befolkning perspektiv til besvare klinisk relevante spørsmål om protein. Metodene er også blitt anvendt for å studere andre potensiator molekyler og deres derivater 20, så vel som effekten av et lite molekyl korrigerings på aktiviteten av proteinet 21.
Efflux-analyser er blitt brukt i mange studier som tidligere for å undersøke aktiviteten av CFTR mutanter og effektene av CFTR-modulerende forbindelser på sin aktivitet, inkludert hele celleanalyser ved bruk av elektroder, radioaktive tracere og fluoroforer 22,23, membranvesikler med ioneselektive elektroder 24 og renset rekonstituert CFTR med radioaktive tracere 25. Men the bruk av ion selektive elektroder for å studere renset rekonstituert CFTR først ble rapportert nylig 19. En tilpasning av den aktuelle metode er blitt anvendt til rekonstituering og funksjonell karakterisering av to membranproteiner i Pseudomonas aeruginosa, en vanlig CF patogen. Tilberedning av renset Alge ytre membran protein kombinert med iodide utstrømningshastigheter målinger ble brukt til å støtte en modell for anioniske alginat sekresjon gjennom denne transporter 26. Rekonstitusjon og jodid-avgivelses målinger ble påført på rensede Wzx protein, noe som tillot en modell til å bli foreslått som antyder en H + -avhengig antiport mekanisme for lipid-tilknyttet oligosakkarid translokasjon over den indre bakterielle membranen ved dette proteinet 27. I begge tilfeller ble jodid anvendt som et surrogat for den anioniske substrat, om enn ved lavere gjennomstrømning enn man kunne vente av et naturlig substrat. Fremgangsmåten kan være egnet for tilpasning til andre proteiner med cationic transport eller ledningsforstyrrelser for anioniske underlag.
Her en hurtig renseprosedyre er beskrevet for CFTR-proteinet og dets tilberedning til proteoliposomes med definert lipid. Den raske omdanningsprosedyren kan lett bli tilpasset for bruk med CFTR renset ved hjelp av andre metoder, forutsatt at den type av vaskemiddel som brukes i rensingen er mottagelig for fjerning av de metoder som brukes her, eller kan byttes ut med et egnet vaskemiddel før omdanningsprosedyren. Den jodid efflux fremgangsmåte for måling av kanalaktivitet av renset og rekonstituert CFTR-proteinet er beskrevet i detalj, og noen typiske resultater som kan oppnås fra denne fremgangsmåten er presentert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har vært et begrenset antall renseprotokoller for full-lengde, funksjonelle CFTR isolert fra en rekke cellulære høyekspresjonsystemer. Metoden som beskrives her er en fordel fordi det gir rask rensing av WT-CFTR eller høy anrikning av F508del- og G551D-CFTR i moderate mengder som er svært funksjonelle i analyser inkludert ATPase og direkte målinger av kanalfunksjon, herunder enkeltkanalmålinger i planar bilags systemer og demonstrerte tiltak av CFTR befolkningen kanal funksjon som er svært relevant for studi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
Riferimenti
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
