Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína
Summary
Descrito aquí es un procedimiento rápido y eficaz para la reconstitución funcional de tipo silvestre purificado y proteína CFTR mutante que conserva la actividad de este canal de cloro, que es defectuoso en la fibrosis quística. Flujo de salida de yoduro de proteoliposomas reconstituidas mediadas por CFTR permite estudios de actividad de los canales y los efectos de las moléculas pequeñas.
Abstract
La fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR) es un miembro de formación de canal único de la casete de unión a ATP (ABC) superfamilia de transportadores. La actividad de los canales de la fosforilación y cloruro dependiente de nucleótidos de CFTR se ha estudiado con frecuencia en los sistemas de células enteras y como canales individuales en fragmentos de membrana rotos. Muchas mutaciones de fibrosis quística causantes se han mostrado alteraciones en esta actividad. Si bien un pequeño número de protocolos de purificación se han publicado, un método de reconstitución rápida que retiene la actividad del canal y un método adecuado para el estudio de la actividad del canal población en un sistema purificado han faltado. Aquí métodos rápidos se describen para la purificación y reconstitución funcional de la proteína CFTR de longitud completa en proteoliposomas de composición de lípidos definida que retiene la actividad como un canal de haluro regulado. Este método de reconstitución junto con un nuevo ensayo basado en flujo de la actividad del canal es un sistema adecuado parael estudio de las propiedades del canal población de tipo salvaje CFTR y los mutantes que causan enfermedades F508del- y G551D-CFTR. Específicamente, el método tiene utilidad en el estudio de los efectos directos de la fosforilación, nucleótidos y moléculas pequeñas tales como potenciadores e inhibidores sobre la actividad del canal CFTR. Los métodos también son susceptibles al estudio de otros canales / transportadores de membrana para sustratos aniónicos.
Introduction
El transporte de cloruro a través de las membranas apicales de las células epiteliales en tejidos tales como las glándulas de pulmón, intestino, páncreas y sudoríparas está mediada principalmente por la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR), un miembro de ATP y la fosforilación regulada de la ABC (ATP Binding Cassette) C subfamilia de proteínas de membrana (revisado en 1). Como otros miembros de la subfamilia ABCC, CFTR es un multi-que abarca proteína de membrana grande, integral que se une ATP en dos sitios de unión de nucleótidos formados en la interfaz de sus dominios de unión a nucleótidos (NBDs), donde posee actividad ATPasa modesta en un solo sitio. Sin embargo, a diferencia de otros miembros de la subfamilia ABCC, CFTR se ha desarrollado como un canal Cl regulado única y no como un transportador de soluto activa.
Las mutaciones en CFTR causa fibrosis quística, una enfermedad que afecta a múltiples órganos, como los pulmones, el tracto gastrointestinal, páncreas y tracto reproductivo, lo que lleva a la morbidity y mortalidad en adultos jóvenes. Enfermedad pulmonar normalmente representa la mortalidad temprana en la fibrosis quística y en la mayoría de los casos es causada por la pérdida de la función de CFTR en el epitelio de la superficie de las vías respiratorias conductoras. La falta de actividad del canal de cloruro CFTR causa una reducción en tanto Cl – y el movimiento del agua a través del epitelio superficial para modificar la capa de fluido en la superficie apical del epitelio respiratorio ciliado. Esto resulta en un líquido viscoso que la superficie de las vías respiratorias deteriora la capacidad de las células epiteliales ciliadas respiratorias a eficazmente patógenos claros fuera de las vías respiratorias. Como consecuencia, la mayoría de los pacientes con FQ sufren de episodios recurrentes de infección pulmonar y daño pulmonar debido a la inflamación.
Como era de esperar, los estudios del mecanismo de acción de la proteína CFTR normal centran principalmente en estudios electrofisiológicos detallados de su actividad gating canal. Estudios de canal individuales han demostrado directamente que las funciones de CFTR como un dependiente de PKA Cl– Canal que posee una puerta regulado ATP 2. Estudios electrofisiológicos detallados proporcionan una gran cantidad de información sobre los canales individuales CFTR 1,3, sin embargo puede haber preocupación en cuanto a si las características de cualquiera de un solo canal particular que ha sido estudiado es el reflejo de toda la población de los canales de CFTR y por lo tanto el canal único Los resultados se deben considerar siempre junto con los métodos para el estudio de la población macroscópica. Ensayo directo de la actividad de los canales población de CFTR purificada tiene el potencial de proporcionar información sobre el defecto molecular asociado con mutaciones que causan enfermedades y para impulsar el descubrimiento de moduladores químicos que la reparación proteínas CFTR mutante. Hasta la fecha, hay más de 1.900 mutaciones diferentes en CFTR se cree causan fibrosis quística 4. La mutación principal, F508del-CFTR, que se encuentra en al menos un alelo en aproximadamente el 90% de los pacientes en América del Norte y Europa conduce a un mal plegamiento de proteínasnd retención en el retículo endoplásmico 5. F508del-CFTR también tiene otras consecuencias, incluyendo la actividad del canal defectuoso 6-9. La ausencia resultante de CFTR de la superficie celular se asocia con la enfermedad severa. G551D-CFTR, una mutación menos común, se cree que aún no se ha plegado correctamente es disfuncional como un canal de cloruro en la superficie celular 6. El desarrollo de pequeñas correctores molécula y potenciadores tiene el objetivo de corregir el plegado y / o el tráfico de mutantes tales como F508del-CFTR a la superficie celular, y de potenciación o el aumento de la actividad de los canales de mutaciones tales como G551D cuando está presente en la superficie celular, respectivamente . Mientras que los correctores VX-809 y VX-661 (todavía no están aprobados para su uso en pacientes, el potenciador Kalydeco (ivacaftor; VX-770) está siendo utilizado en 150 mg cada 12 h en pacientes con FQ> 6 años con al menos un G551D mutación -CFTR, y más recientemente en los pacientes con una de G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Py G1349D. Kalydeco es seguro y los resultados en la mejora de las medidas clínicas de la enfermedad CF 10, sin embargo, el mecanismo de acción de esta pequeña molécula fue mal entendido en el momento de aprobación de la FDA para su uso en pacientes.
Un puñado de métodos de purificación CFTR se han descrito anteriormente 2,11-18, muchas de las cuales requieren un período considerable de tiempo para completar. En una publicación reciente 19, un método de purificación y reconstitución rápida única fue descrito por CFTR sobreexpresa en el sistema de expresión de células 9 S f, y esta proteína purificada en sistemas lipídicos definidos se utilizó para desarrollar un haluro de CFTR ensayo de actividad de canal para una población de CFTR moléculas. El ensayo recapitula los efectos conocidos de la fosforilación, nucleótidos y los inhibidores sobre la función de CFTR. Se utilizó el sistema para interrogar a los efectos de la potenciador VX-770 / Kalydeco en peso (de tipo salvaje), F508del- y G551D-CFTR y se demostró por primerael tiempo que el fármaco interactúa directamente con la proteína CFTR para potenciar su actividad de los canales de una manera independiente de ATP, lo que demuestra la utilidad y aplicabilidad de estos métodos para el estudio de la interacción de CFTR y mutantes con nucleótidos y moléculas pequeñas desde una perspectiva de la población a responder a las preguntas clínicamente relevantes sobre la proteína. Los métodos también se han utilizado para estudiar otras moléculas potenciadoras y sus derivados 20, así como los efectos de una pequeña molécula corrector sobre la actividad de la proteína 21.
Ensayos de eflujo se han utilizado en muchos estudios previamente para investigar la actividad de mutantes CFTR y los efectos de los compuestos CFTR-moduladores en su actividad, incluyendo los ensayos de células enteras utilizando electrodos, trazadores radiactivos y fluoróforos 22,23, vesículas de membrana con electrodos selectivos de iones 24 y se purificaron CFTR reconstituido con trazadores radiactivos 25. Sin embargo the uso de electrodos selectivos de iones para estudiar CFTR reconstituido purificado se informó por primera vez recientemente 19. Una adaptación del método actual se ha utilizado para la reconstitución y la caracterización funcional de dos proteínas de membrana en Pseudomonas aeruginosa, un patógeno CF común. Reconstitución de purificado proteína de membrana externa AlgE junto con mediciones de flujo de salida de yoduro se utilizaron para apoyar un modelo para la secreción de alginato aniónico a través de este transportador 26. Reconstitución y mediciones de yoduro de eflujo se aplicaron a la proteína purificada Wzx, lo que permitió un modelo que se propone que sugiere un mecanismo de antiport dependiente de H + para lípidos ligado oligosacárido translocación a través de la membrana interna bacteriana por esta proteína 27. En ambos casos yoduro fue utilizado como un sustituto para el sustrato aniónico, aunque a un menor rendimiento que uno podría esperar para un sustrato nativo. El método puede ser adecuado para la adaptación a otras proteínas con cvías de transporte o de conducción ationic para sustratos aniónicos.
Aquí un procedimiento de purificación rápida se describe para la proteína CFTR y su reconstitución en proteoliposomas de lípidos definida. El procedimiento de reconstitución rápida se puede adaptar fácilmente para su uso con CFTR purificada por otros métodos, siempre que el tipo de detergente usado en la purificación es susceptible a la eliminación por los métodos utilizados aquí o puede ser intercambiado por un detergente adecuado antes de que el procedimiento de reconstitución. El método de yoduro de eflujo para la medición de la actividad del canal de la proteína CFTR purificada y reconstituida se describe en detalle y se presentan algunos resultados típicos que se pueden obtener a partir de este método.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ha habido un número limitado de protocolos de purificación para de longitud completa, el aislamiento CFTR funcional, a partir de una variedad de sistemas de sobreexpresión celulares. El método descrito aquí es ventajosa, ya que permite la purificación rápida de WT-CFTR o alto enriquecimiento de F508del- y G551D-CFTR en cantidades moderadas que es altamente funcional en ensayos que incluyen ATPasa y mediciones directas de la función del canal, incluyendo mediciones de canal individuales en bicapa planar sistemas …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
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