प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के बहुमुखी लाभ में<em> Escherichia कोलाई</em
Summary
Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.
Abstract
We report here that the expression of protein complexes in vivo di Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.
Introduction
overexpression प्रौद्योगिकियों की शुरुआत कम प्रतिलिपि संख्या एंजाइमों के जैव रासायनिक अध्ययन और औषधीय सक्रिय प्रोटीन (जैसे, इंसुलिन) के औद्योगिक उत्पादन या तो बढ़ाया है। इन प्रौद्योगिकियों के आगमन के बाद से, महत्वपूर्ण प्रगति पुनः संयोजक प्रोटीन की उपज और गुणवत्ता बढ़ाने के लिए हासिल किया गया है। इसके अलावा, प्रोकार्योटिक 1,2 और यूकेरियोटिक 3 overexpression सिस्टम प्रोटीन जैव प्रौद्योगिकी, यानी, Escherichia कोलाई के "काम घोड़ा" के लिए उपयोगी विकल्प की पेशकश की, पिछले कुछ वर्षों में विकसित किया गया। ई करने के लिए वैकल्पिक प्लेटफार्मों की विशेष रूप से, उपलब्धता कोलाई पुनः संयोजक पेप्टाइड्स या बाद translational संशोधनों असर प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए नेतृत्व किया। हालांकि, यह है कि उल्लेख किया जाना चाहिए ई कोलाई अभी भी पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए पसंद की जीव का प्रतिनिधित्व करता है। यह सबसे अधिक प्रासंगिक हो सकता है, जो बीच में कई कारकों की वजह से हैमाना जाता है: मैं) overexpression सिस्टम (अभिव्यक्ति वैक्टर और दबाव की काफी संख्या की उपलब्धता) ई के लिए कोलाई 1,2; ई की द्वितीय) लघु पीढ़ी बार, और उच्च बायोमास पैदावार, अमीर और सिंथेटिक मीडिया के एक किस्म में कोलाई; iii) के जैव रासायनिक और इस सूक्ष्मजीव की आनुवंशिक स्तर पर या तो सतही हेरफेर; चतुर्थ) जहरीले प्रोटीन 4 का उत्पादन करने में सक्षम उपभेदों के अलगाव; V) जनसंख्या स्तर 5,6 पर सजातीय प्रेरण की विशेषता उपभेदों का निर्माण। इसके अलावा, यह हाल ही में ई में उत्पादन के लिए उपयुक्त है कि अभिव्यक्ति सिस्टम दिखाया गया था पोस्ट-translationally संशोधित प्रोटीन की कोलाई तैयार कर लिया है और 2 का निर्माण किया जा सकता है।
वर्तमान में, प्रोटीन overexpression मुख्य रूप से जिसका hypersynthesis एक उपयुक्त प्लाज्मिड में क्लोन एक जीन के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है मोनोमेरिक या होमो-oligomeric प्रोटीन प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, ध्यान हाल ही में किया गया थाई का निर्माण करने के लिए भुगतान कोलाई प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्रणाली, असमलैंगिक oligomeric परिसरों 2 की, विवो में, उत्पादन को चुनौती दे। दिलचस्प है, प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के प्रारंभिक प्रयोगों cyanobacterial ribulose-1,5-बाइफोस्फेट कार्बोज़ाइलेस / oxygenase 7,8 के बड़े और छोटे सब यूनिटों की अंतर-प्रजाति, विधानसभा और एचआईवी -1 से छोटा और पूर्ण लंबाई रूपों की एसोसिएशन को संबोधित किया ट्रांसक्रिपटेस 9 रिवर्स। इन अग्रणी पढ़ाई प्रोटीन सह अभिव्यक्ति विट्रो पुनर्गठन में पारंपरिक करने के लिए एक शक्तिशाली विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है कि प्रदर्शन किया। ई में इसके अलावा, प्रोटीन सह अभिव्यक्ति कोलाई अप्राकृतिक अमीनो एसिड दो युक्त प्रोटीन प्राप्त करने के लिए, बाद translational संशोधनों 2 असर अलग प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए, और overexpressed झिल्ली प्रोटीन 2 की उपज बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, एक उपकरण के रूप में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति की क्षमता का ई करने के लिए प्रदान करने के लिए कोलाई प्रतिस्पर्धाप्रोटीन स्राव में nce के सक्रिय जांच 2 के अधीन है।
ई में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति की दो मुख्य रणनीतियों कोलाई चलाया जा सकता है: विभिन्न जीनों की मेजबानी के लिए एक एकल प्लाज्मिड का उपयोग overexpressed होने के लिए मैं); द्वितीय) एकल कक्षों में कई plasmids के उपयोग के लक्ष्य प्रोटीन सह-व्यक्त करने के लिए। मिलकर प्रमोटर / ऑपरेटर तत्वों से युक्त विशेष प्लास्मिड सह अभिव्यक्ति 10 के लिए निर्माण किया गया है, हालांकि पहले मामले में, प्लाज्मिड के चुनाव के लिए मापदंड, पारंपरिक एकल प्रोटीन overexpression के प्रयोगों के उन लोगों से अलग नहीं है। यह पहला दृष्टिकोण इसलिए काफी सरल है। हालांकि, यह अलग प्रोटीन सह-व्यक्त करने के लिए एक एकल प्लाज्मिड के उपयोग के दो प्रमुख कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है कि उल्लेख किया जाना चाहिए: मैं) के सह-व्यक्त प्रोटीन की संख्या सीमित की मेजबानी जीनों की संख्या के साथ वेक्टर बढ़ जाती है, के आणविक जन; द्वितीय) एकाधिक जीन एक ही प्रमोटर के नियंत्रण के तहत क्लोन कर रहे हैं, जब polarity के decreas कर सकते हैंप्रमोटर से बाहर का जीनों की अभिव्यक्ति ई। एकल ई में दोहरी या कई plasmids के उपयोग कोलाई कोशिकाओं इसलिए plasmids के पात्र संयोजन करने के लिए बाधाओं लगाने, चुनाव के वैक्टर की अनुकूलता को पूरा करने के लिए है। हालांकि, इस दूसरे सह अभिव्यक्ति रणनीति वैक्टर की आणविक जन युक्त का लाभ सुविधाएँ, और polarity सीमित करता है। हमने हाल ही में सह अभिव्यक्ति प्लास्मिड 11 के बीच जीनों के चक्कर सुविधा के लिए बनाया एक प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्रणाली का निर्माण किया। विशेष रूप से, हम pGOOD वैक्टर श्रृंखला का निर्माण, प्रासंगिक, जो सुविधाओं के होते हैं: मैं) प्रतिकृति के एक p15A मूल, वाणिज्यिक वैक्टर (जैसे, pBAD श्रृंखला 12) ColE1 मूल को रोकने के साथ pGOOD प्लास्मिड की अनुकूलता प्रदान करने के लिए; ii) टेट्रासाइक्लिन-प्रतिरोध कैसेट; III) लाख की उपस्थिति नियामक तत्व है, यानी, प्रवर्तक-संचालक (ओ 1) जोड़े और Laci व्युत्पन्न </eएम> क्यू जीन। एक उपयुक्त pBAD-pGOOD जोड़ी का उपयोग कर, हम ई की उत्प्रेरक कोर overexpress करने में सक्षम थे तीन अलग-अलग यूनिटों से बना कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ III, यानी, α (5'-3 'पोलीमर्स), ε (3'-5' exonuclease) और (स्थिर ε) 13 θ। विशेष रूप से, हम αεθ परिसर के सह अभिव्यक्ति ई अलावा करने के लिए सख्ती पर निर्भर था कि प्रदर्शन IPTG और arabinose दोनों की कोलाई संस्कृति के माध्यम से, pGOOD और pBAD, क्रमशः (चित्रा 1 ए) से ट्रिगर overexpression।
वर्तमान रिपोर्ट में, हम प्रोटीन सह अभिव्यक्ति कुशलता से एक प्रोटीन जटिल सबयूनिट के गरीब विलेयता से जुड़ा हुआ कठिनाइयों को हल कर सकते वर्णन कैसे। इसके अलावा, हम कैसे विवो प्रोटीन पूरक परीक्षा में प्रदर्शन किया जा सकता है दिखाने के लिए, और हम अंत में ई में धुन उत्परिवर्तन आवृत्ति के लिए प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के उपयोग पर रिपोर्ट ज़ीनमेँ। इस उद्देश्य के लिए, हम प्रत्येक मामले के अध्ययन के लिए प्रासंगिक उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए उपयुक्त pGOOD-pBAD जोड़ों का इस्तेमाल किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन जिसका तृतीयक संरचना रचना 25 की सीमित संख्या के लिए आरक्षित नहीं है क्षेत्रों की विशेषता, आंतरिक रूप से अव्यवस्थित हो सकता है। ये अव्यवस्थित प्रोटीन एकत्रीकरण से 25 आम तौर पर ग्रस्त हैं, औ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आंकड़े पुनर्मुद्रण स्प्रिंगर और एल्सेविअर द्वारा अनुमति बहुत स्वीकार किया है।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
Riferimenti
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