Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em> Escherichia coli</em
Summary
Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.
Abstract
We report here that the expression of protein complexes in vivo di Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.
Introduction
L'introduction des technologies de surexpression soit stimulé les études biochimiques du faible nombre de copies enzymes et la production industrielle de protéines pharmacologiquement actives (par exemple, l'insuline). Depuis l'avènement de ces technologies, des progrès significatifs ont été réalisés pour augmenter le rendement et la qualité des protéines recombinantes. En outre, 1,2 procaryotes et eucaryotes 3 systèmes de surexpression ont été développés au cours des années, offrant des alternatives utiles à la "cheval de travail" de la biotechnologie de la protéine, ce est à dire, Escherichia coli. En particulier, la disponibilité des plates-formes alternatives à E. coli conduit à la production de peptides ou de protéines portant des modifications post-traductionnelles de recombinaison. Toutefois, il convient de mentionner que E. coli représente encore l'organisme de choix pour la production de protéines recombinantes. Cela est dû à plusieurs facteurs, parmi lesquels peuvent être les plus pertinentsconsidéré: i) la disponibilité d'un certain nombre de systèmes de surexpression (vecteurs d'expression et souches) pour E. coli 1,2; ii) fois le court de production, et des rendements élevés de la biomasse, de E. coli dans une variété de médias riche et synthétique; iii) la manipulation facile, soit à la substance biochimique et génétique au niveau de ce micro-organisme; iv) l'isolement de souches capables de produire des protéines toxiques 4; v) la construction de souches présentant induction homogène au niveau de la population 5,6. En outre, il a été récemment montré que des systèmes d'expression appropriés pour la production dans E. coli de protéines modifications post-traductionnelles peut être conçu et construit deux.
À l'heure actuelle, surexpression de la protéine est principalement utilisé pour obtenir des protéines monomères ou homo-oligomères, dont hypersynthése peut être réalisée avec un seul gène cloné dans un plasmide approprié. Toutefois, l'attention a récemment étéversée à la construction de E. systèmes protéines co-expression coli, contestant la production, in vivo, de complexes hétéro-oligomères 2. Fait intéressant, les premières expériences de protéines co-expression adressé à l'Assemblée inter-espèces de grands et de petits sous-unités de carboxylase cyanobactéries ribulose-1,5-bisphosphate / oxygénase 7,8, et l'association des formes tronquées et pleine longueur du VIH-1 transcriptase inverse neuf. Ces études pionnières ont démontré que la protéine co-expression représente une alternative puissante et traditionnelles dans la reconstitution in vitro. En outre, la protéine co-expression dans E. coli a été utilisée pour produire différentes protéines portant des modifications post-traductionnelles 2, pour obtenir des protéines contenant des acides aminés non naturels 2, et d'augmenter le rendement des protéines membranaires surexprimés 2. En outre, le potentiel de la protéine co-expression en tant qu'outil de conférer à E. coli concurrencence dans la sécrétion de protéines est sous enquête active 2.
Deux principales stratégies de protéines co-expression dans E. coli peut être poursuivi: i) l'utilisation d'un seul plasmide d'accueillir les différents gènes pour être surexprimé; ii) l'utilisation de plusieurs plasmides dans des cellules individuelles pour co-exprimer les protéines cibles. Dans le premier cas, les critères pour le choix du plasmide ne diffèrent pas de ceux des expériences traditionnelles protéines de surexpression simples, bien que particulier des plasmides contenant des éléments promoteur / opérateur en tandem ont été construits pour la co-expression 10. Cette première approche est donc très simple. Toutefois, il convient de mentionner que l'utilisation d'un seul plasmide de co-exprimer des protéines différentes se heurte à deux difficultés majeures: i) la masse moléculaire du vecteur augmente avec le nombre de gènes hébergés, ce qui limite le nombre de protéines co-exprimées; ii) lorsque plusieurs gènes sont clones sous le contrôle d'un promoteur unique, la polarité peut dimienvoyer l'expression des gènes à partir du promoteur distal. L'utilisation de plasmides double ou multiple unique dans E. cellules coli doit accomplir la compatibilité des vecteurs de choix, donc imposer des contraintes aux combinaisons admissibles de plasmides. Toutefois, cette deuxième stratégie de co-expression comporte l'avantage de contenir la masse moléculaire de vecteurs, et limite la polarité. Nous avons récemment construit un système de co-expression de protéines conçu pour faciliter le mouvement alternatif de gènes entre les plasmides co-expression 11. En particulier, nous avons construit la série de vecteurs de pgood, les éléments pertinents qui sont: i) une origine de p15A de réplication, pour assurer la compatibilité des plasmides pgood avec les vecteurs commerciaux contenant l'origine ColE1 (par exemple, la série pBAD 12); ii) une cassette de résistance à la tetracycline; iii) la présence du lac -derived éléments de régulation, ce est à dire, le promoteur-opérateur (O 1) En couple et la LACI </em> q gène. Utiliser un couple pBAD-pgood appropriée, nous avons pu surexpriment le noyau catalytique de E. coli DNA polymerase III, composé de trois sous-unités différentes, ce est-α (la polymerase, ε (3'-5'-3 '5)' exonucléase) et θ (ε stabilisant) 13. En particulier, nous avons démontré que la co-expression du complexe de αεθ était strictement dépendante de l'ajout de la E. coli milieu de culture à la fois de l'IPTG et arabinose, le déclenchement et la surexpression de pgood pBAD, respectivement (figure 1A).
Dans le présent rapport, nous illustrons comment des protéines co-expression peut résoudre efficacement les difficultés liées à la faible solubilité d'une protéine sous-unité complexe. En outre, nous montrons comment dans des tests de complémentation de protéines in vivo peut être effectuée, et nous rapportons enfin sur l'utilisation de protéines co-expression de régler la fréquence de mutation dans E. coli. Dans ce but, nous avons utilisé les couples pgood-PBAD appropriés pour illustrer des exemples pertinents de chaque étude de cas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protéines peuvent être intrinsèquement désordonnée, avec des régions dont la structure tertiaire ne est pas restreinte à un nombre limité de conformations 25. Ces protéines désordonnées sont généralement sujettes à l'agrégation 25, et de leur isolement et la caractérisation pourraient représenter une tâche difficile. La sous-unité ε de E. coli DNA polymerase III possède deux domaines distincts 26,27, à savoir: i) le domaine N-ter, portant la 'ac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'autorisation par Springer et Elsevier réimprimer chiffres est grandement reconnu.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
Riferimenti
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