タンパク質の共発現の多面的メリットで<em>エシェリヒア·コリ</em
Summary
Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.
Abstract
We report here that the expression of protein complexes in vivo di Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.
Introduction
過剰発現技術の導入は、低コピー数の酵素の生化学的研究および薬理学的に活性なタンパク質（ 例えば、インスリン）の工業的製造のいずれかをブースト。これらの技術の出現以来、重要な進歩は、組み換えタンパク質の収量と品質を高めるために達成された。さらに、原核生物および真核1,2 3過剰発現システムは、タンパク質バイオテクノロジー、 すなわち、大腸菌の「作業馬」に有用な選択肢を提供し、長年にわたって開発された。 E.の代替プラットフォーム特に、可用性大腸菌は、翻訳後修飾を有する組換えペプチドまたはタンパク質の産生をもたらした。しかし、E.ことが言及されるべきである大腸菌は依然として組換えタンパク質生産のための選択の生物を表す。これは最も関連があることができ、その中のいくつかの要因によるものであると考えた：i）過剰発現システム（発現ベクターおよび菌株のかなりの数の可用性が）E.のために大腸菌 1,2。 ii）の短い世代時間を、高いバイオマス収量、E.の豊かで合成様々なメディアで大腸菌 。 ⅲ）生化学的で、その微生物の遺伝子レベルでのいずれかの容易な操作。 iv）の毒性タンパク質4の産生が可能な株の単離を、 v）が集団レベル5,6で均質誘導を搭載株の構築。また、最近E.生産に適した発現系が示された翻訳後修飾タンパク質の大腸菌が考案2を構成することができる。
現在では、タンパク質の過剰発現は、主にそのhypersynthesis適切なプラスミドにクローニングし、単一の遺伝子を用いて行うことができる単量体またはホモオリゴマータンパク質を得るために使用される。ただし、注意が最近だったEの建設に支払わヘテロオリゴマー複合体2の大腸菌タンパク質の共発現系、 インビボで 、生産に挑戦。興味深いことに、タンパク質の同時発現の初期の実験では、シアノバクテリアのリブロース-1,5-ビスリ ン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ7,8、及びHIV-1の切断型および全長型の関連性の大小サブユニットの種間組立体を取り上げ転写酵素9の逆。これらの先駆的な研究は、タンパク質の共発現は、in vitro再構成における伝統的に強力な代替手段を表していることを実証した。加えて、タンパク質の共発現E.で大腸菌は、非天然アミノ酸2を含有するタンパク質を得るために、翻訳後修飾2を有する異なるタンパク質を生成するために、及び過剰発現した膜タンパク質2の収量を増大させるために使用した。また、ツールとしてのタンパク質共発現の電位はEに付与するコリが競うタンパク質分泌におけるNCEは、アクティブな捜査2の下にある。
E.におけるタンパク質共発現の二つの主な戦略大腸菌を追求することができます：ⅰ）単一のプラスミドの使用が過剰発現されることが異なる遺伝子をホストする。 ii）は、単一セル内の複数のプラスミドの使用は、標的タンパク質を同時発現する。タンデムプロモーター/オペレーター要素を含む特定のプラスミドを共発現10のために構築されたが、最初のケースでは、プラスミドの選択の基準は、従来の単一のタンパク質の過剰発現実験のものと異ならない。この最初のアプローチは、したがって、非常に簡単です。しかし、異なるタンパク質を共発現する単一プラスミドの使用は、二つの主要な困難に直面していることが言及されるべきである：i）の共発現されたタンパク質の数を制限するホストされる遺伝子の数を有するベクトルが増加すると、分子量;複数の遺伝子は、単一プロモーターの制御下にクローニングされた場合ii）は、極性がdecreasできプロモーターから遠位の遺伝子の発現を電子。シングルE.でデュアルまたは複数のプラスミドの使用大腸菌細胞は、従って、プラスミドの適格な組み合わせに制約を課し、選択したベクターとの適合性を達成しなければならない。しかし、この第2の共発現戦略は、ベクターの分子量を含むという利点を備えており、極性が制限される。我々は最近、同時発現プラスミド11との間の遺伝子の往復を容易にするように設計されたタンパク質の共発現系を構築した。特に、我々はPGOODベクトルシリーズを構築し、関連する機能には、そのうちのは、i）p15A複製起点は、市販のベクター（ 例えば、のpBADシリーズ12）のColE1起点を含むとPGOODプラスミドの互換性を提供する。 ⅱ）テトラサイクリン耐性カセット。 ⅲ）LACの存在は調節エレメント、 すなわち、プロモーター-オペレーター（O 1）夫婦とのlacIの由来</eM> q遺伝子 。適切なのpBAD-PGOODのカップルを使用して、我々はEの触媒コアを過剰発現することができました三つの異なるサブユニット、 すなわち α（5'-3 'ポリメラーゼ）、ε（3'-5'エキソヌクレアーゼ）とθ（εを安定化する）13から構成される大腸菌 DNAポリメラーゼIII、。特に、我々はαεθ複合体の共発現はE.のほかに厳密に依存することを実証したIPTGおよびアラビノースの両方の大腸菌培養培地、PGOODとのpBAD、それぞれ（ 図1A）からトリガ過剰発現。
今回の報告では、タンパク質の共発現を効率的にタンパク質複合体のサブユニットの乏しい溶解性にリンクされて困難を解決することができる方法を示しています。さらに、我々は、in vivoでのタンパク質相補性試験を行うことができ、我々は最終的にE.で調整変異頻度のタンパク質の共発現の使用について報告する方法を示しコル私は。この目的のために、私たちはそれぞれのケーススタディの関連する例を説明するために、適切なPGOOD-のpBADのカップルを使用していました。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質は、その三次構造の立体配座25の限られた数に制限されていない領域が特徴、本質的に無秩序であることができる。これらの無秩序のタンパク質は、通常、25を凝集する傾向があり、それらの単離および特徴付けは困難なタスクを表すこと。 Eのεサブユニット大腸菌 DNAポリメラーゼIIIの機能つの異なるドメイン、すなわち26,27、は、i）N-スタ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
数字を再印刷するスプリンガーとエルゼビアの許可が大幅に認められている。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
Riferimenti
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochimica. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochimica. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochimica. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E., McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
