Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em> Escherichia coli</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo di Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

overekspresyonu teknolojilerin tanıtılması düşük kopya sayısı enzimlerin biyokimyasal çalışmalar ve farmakolojik olarak aktif proteinlerin (örneğin, insülin) sanayi üretimi ya artırdı. Bu teknolojilerin gelişiyle bu yana, önemli gelişmeler rekombinant proteinlerin verim ve kaliteyi artırmak için elde edilmiştir. Buna ek olarak, prokaryotik ve ökaryotik ^{1,2 3} ekspresyonu sistemleri, protein biyoteknoloji, yani, Escherichia coli "iş atı" yararlı alternatifler sunan, yıllar içinde geliştirilmiştir. E. alternatif platformların Özellikle, kullanılabilirlik E. coli rekombinant peptitler veya post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan proteinlerin üretimine yol açtı. Bununla birlikte, söz edilmelidir E. E. coli halen yeniden birleştirici protein üretimi için tercih edilen bir organizmayı ifade eder. Bu en alakalı olabilir aralarında çeşitli faktörler, nedeniylekabul: i) ekspresyonu sistemleri (ifade vektörleri ve suşları oldukça bir dizi kullanılabilirlik) E. için E. coli ^1,2; E. ii) Kısa nesil süreleri ve yüksek biyokütle verimi, Zengin ve sentetik medya çeşitli coli; iii) biyokimyasal olarak ve bu mikroorganizmanın genetik düzeyde ya uyduruk manipülasyon; iv), toksik proteinlerin ⁴ üretebilen suşlarının izole edilmesi; v) nüfus düzeyinde ^5,6 homojen indüksiyon sahip suşlar yapımı. Buna ek olarak, son zamanlarda, E. üretimi için uygun olan bu ifade sistemleri gördü translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinlerin E. coli tasarlanmış ve ² yapılabilir.

Şu anda, proteini aşırı ekspresyonu esas olan hypersynthesis uygun bir plasmid içine klonlanmış tek bir gen ile yapılabilir monomerik ya da homo-oligomerik proteinler elde etmek için kullanılır. Bununla birlikte, dikkat son zamanlardaE. inşaat ödenen coli proteini birlikte ifade sistemleri, bir hetero-oligomerik kompleksleri ^2, in vivo olarak, üretim zorlu. İlginç bir şekilde, protein, birlikte-ifade edilme daha önceki deneylerde, siyanobakteri ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilazın / oksijenaz ^7,8 arasında büyük ve küçük alt birimleri ve türler arası düzeneği, ve HIV-1 kesik ve tam uzunluktaki formları arasındaki ilişkiyi ele transkriptaz ⁹ ters. Bu öncü çalışmalar, protein ko-ifadesi in vitro yeniden geleneksel güçlü bir alternatif temsil ettiğini göstermiştir. E. koli içinde ilave olarak, protein, ko-ekspresyonu E. coli doğal olmayan amino asitler ² ihtiva eden proteinler elde etmek için, post-translasyonel modifikasyonlar ² taşıyan çeşitli proteinleri üretmek için ve Süreksprese membran proteinlerinin ² verimini artırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, bir araç olarak bir protein birlikte-ifade edilme potansiyel E. kazandırma coli rekabetProtein salgılanması nce aktif soruşturma ² altında.

E. Protein birlikte-ifade edilme iki temel strateji coli takip edilebilir: Farklı genleri barındırmak için tek bir plazmid kullanımı aşın i); ii) tek bir hücre içinde birden fazla plasmidlerin kullanımı hedef proteinlerin yardımcı şekilde ifade etmek. Tandem promotör / operatör elemanları ihtiva eden, özellikle plazmidler ko-ekspresyonu ¹⁰ oluşturulmuştur, ancak ilk durumda, plazmid seçimi için kriterler, geleneksel tek bir protein aşın deney olanlardan farklı değildir. Bu ilk yaklaşım bu nedenle oldukça basittir. Bununla birlikte, farklı proteinler yardımcı şekilde ifade etmek tek plazmidin kullanılması, sağlamanın iki büyük bir zorlukla karşı karşıya olduğu belirtilmelidir: i) eş ifade edilen proteinlerin sayısının sınırlandırılması barındırılan genlerin sayısı ile vektör artar, moleküler kütlesi; ii) birden fazla gen, tek bir promotörün kontrolü altında klonlandı zaman, polarite gerilemenin olabilirpromoterinden distal genlerin ifadesi e. Tek E., ikili veya çoklu plasmidlerin kullanımı coli hücreleri, bu nedenle plazmid uygun kombinasyonlarla kısıtlamalar getiren, seçilen vektörler uyumluluğunu gerçekleştirmek zorundadır. Bununla birlikte, bu ikinci eş ifade stratejisinin vektörlerinin molekül kütlesi ihtiva eden bir avantaj sahiptir, ve polarite sınırlar. Son zamanlarda birlikte ekspresyon plazmidleri ¹¹ arasında gen mekik kolaylaştırmak için tasarlanmış bir protein ko-ifade sistemi inşa edilmiştir. Özellikle, pGOOD vektörleri serisi inşa ilgili özellikler elde edilmiştir: i) bir replikasyon orijini p15A, ticari vektörler (ör pBAD seri ¹²⁾ ColE1 orijini içeren pGOOD plazmid uyumluluğunu sağlamak; ii) bir tetrasiklin direnç kasedi; iii) lac varlığı düzenleyici unsurları, yani Yarışmayı-Operatörü (O ₁₎ çift ve IacI -türevli </em> ^q geni. Uygun bir pBAD-pGOOD çift kullanarak, E. katalitik çekirdeğini aşırı ifade başardık üç farklı alt üniteden oluşan coli DNA polimeraz III, yani α (5'-3 'polimeraz), ε (3'-5' eksonükleaz) ve (stabilize edici ε) ¹³ θ. Özellikle, αεθ kompleksinin birlikte ifadesi, E. ek sıkı sıkıya bağlı olduğunu göstermiştir IPTG ve arabinoz hem de E. coli kültür ortamı, pGOOD ve pBAD sırasıyla (Şekil 1A), tetikleyici aşırı ekspresyonu.

Mevcut yazıda, proteinin birlikte ifadesi, etkin bir şekilde bir protein kompleksi alt biriminin çözünürlüğünün kötü bağlantılı zorlukların üstesinden nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, ne kadar in vivo proteinin tamamlama testlerinde gerçekleştirilebilir göstermektedir, ve nihayet E. ayar mutasyon sıklığı protein ko-ifade edilmesi için rapor dağ geçidii. Bu amaçla, her vaka çalışması ilgili örnekler göstermek için uygun pGOOD-pBAD çiftler kullanılır.

Protocol

E. 1. izolasyonu E. coli Eş transformantlar Uygun E. elektro-yetkili hücreleri hazırlayın coli suşu transforme edilecek. LB ortamı, 1 ml (tripton, maya ekstresi, 10 NaCl, 5, ve 10 g / l'lik konsantrasyonlarda kullanılır) tercih edilen soyunun tek bir koloni, ve transfer 180 rpm çalkalama koşulları altında, 37 ° C'de inkübe edin. Ön-kültür 1 seyreltin: 500, taze LB ortamında 25 ml ve 37 ° C'de kültür inkübe edin. Log-faz (0.6 OD) i…

Representative Results

E. ε alt birimi E. coli DNA polimeraz III 243 amino asitten oluşur ve kalıntılar 187-243 17 silinir sürece, zayıf çözünürlüğe 17,18 bulunmaktadır. Bununla birlikte, daha önce tam uzunlukta α, ε ve θ alt birimlerinin birlikte ifadesi, çözünür bir DNA polimeraz III katalitik çekirdek (Şekil 1) elde edilir ki 11 göstermiştir. I) α ve ε alt birimden fazla sentezlenmesi, bağımsız olarak arabinoz ve IPTG sırasıyla (Şek…

Discussion

Proteinler olan üçüncül yapı uyumlarının ²⁵ arasında, sınırlı sayıda sınırlı değildir bölgeleri içeren, doğal olarak düzensiz olabilir. Bu düzensiz proteinler toplama ²⁵ genellikle eğilimli, ve onların izolasyon ve karakterizasyonu zor bir görev temsil edebilir. E. ε alt birimi coli DNA polimeraz III iki farklı etki yani ^26,27, özellikleri: i) N-ter etki, θ alt birimini bağlama 3'-5 'ekzonükleaz aktivitesini taşıyan ve yetkin; ii)…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix