Muizen geïsoleerde hart Model van myocard Stunning Associated met Cardioplegisch Arrestatie
Summary
The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.
Abstract
Het volgende protocol is gebruikt om een verminderde hartfunctie of myocard prachtige volgende matig ischemische beledigingen evalueren. De techniek is nuttig voor het modelleren van ischemisch letsel in verband met een groot aantal klinisch relevante fenomeen zoals hartchirurgie met cardioplegische arrestatie en cardiopulmonale bypass, off-pump CABG, transplantatie, angina, korte ischemie, enz. Het protocol stelt een algemene methode met model hypothermie hyperkalemic cardioplegische arrestatie en reperfusie in knaagdieren harten gericht op metingen van myocardiale contractiliteit. In het kort wordt een muis hart doorbloed in Langendorff-modus, geïnstrumenteerd met een intraventriculaire ballon, en de baseline cardiale functionele parameters worden geregistreerd. Na stabilisatie, het hart is dan onderworpen aan infusie van een cardioprotective onderkoeld cardioplegia oplossing kort te diastolische arrestatie starten. Cardioplegie wordt met tussenpozen meer dan 2 uur geleverd. Het hart wordt vervolgens reperfusie en warmed om normotherme temperaturen en het herstel van myocardiale functie wordt gecontroleerd. Gebruik van dit protocol resulteert in betrouwbare depressief cardiale contractiele functie vrij van grove myocard weefselschade bij knaagdieren.
Introduction
Myocardiale verdoving gedefinieerd als omkeerbare contractiele activiteit ondanks herstel van adequate bloedstroming na een korte periode van ischémie en langere perioden van ischemie beledigingen met cardioprotectie 1,2,3,4,5. De gepresenteerde methode wordt specifiek gebruikt voor het modelleren klinisch relevante ischemische beledigingen die kan leiden tot omkeerbare stoornissen in contractiele functie (bijv ischemische beledigingen verbonden aan hartchirurgische cardioplegie gebruik arrestatie korte perioden van ischemie, angina, etc.). In tegenstelling tot ernstige ischemie studies (myocardinfarct, necrose) werd dit protocol ontwikkeld om myocard functioneel herstel en cardioprotectie zonder weefselbeschadiging, verbouwing en celdood te evalueren. De meeste artikel bespreekt een standaard cardioplegisch aanhouding protocol met elementen gelijkend op een hartoperatie behulp onderkoeling en intermitterende cardioplegie levering.
Myocard proteel tijdens het grootste deel van hartoperaties voert cardioplegie en cardiopulmonale bypass. Hoewel cardioplegia (CP) oplossingen en strategieën lopen sterk uiteen (bloed, kristalachtige, koud, warm etc.) de meest voorkomende elementen zijn 1) hyperkaliëmie en / of andere strategieën om het hart stil in diastole, waardoor energiebenutting gevolg van myocardiale contractie beperken en 2) onderkoeling te vertragen stofwisseling en helpen handhaven ATP en andere energie-reserves, terwijl gearresteerd. Huidige cardioplegie oplossingen bieden bescherming aan het hart tegen ischemische beledigingen die anders dodelijk zou blijken. Echter, cardioprotectieve strategieën tijdens chirurgische ischemische beledigingen niet perfect, en het resulterende milde ischemische letsels leiden reversibele cardiale contractiele dysfunctie ondanks adequate bloedstroming (myocard verdoven), acidose, cardiomyocyt schade en vasculaire effecten waaronder verminderde coronaire perfusie en vasospasme.
Dit protocol verschiltvan standaard geïsoleerde hart ischemiemodellen evalueren myocardiaal infarct en ernstige ischemie doordat evalueert mildere ischemische beledigingen wat kan leiden tot verminderde hartfunctie volgende korte ischémie of ischemische beledigingen geassocieerd met cardioplegie arrest. (Voor een overzicht op Langendorff perfusie technieken en I / R studies zie 6-8). Voor algemene richtlijnen en een grondige analyse van de experimentele parameters in verband met de muis geïsoleerd geperfuseerde harten zie Sutherland e t al. 2003 9 De hier gepresenteerde techniek worden de benodigde apparatuur, reagentia, stappen, strategieën en tips om betrouwbaar te induceren schitterend in de muis harten. Kleine aanpassingen zijn nodig om de techniek te gebruiken om ratten.
Kort geïsoleerd muisharten zijn Langendorff perfusie gedurende ongeveer 30 minuten onder fysiologische Krebs-Henseleit buffer (KHB), gevolgd door koude beschermde hartstilstand via afgifte van een hyperkalemic hypothermic cardioplegie oplossing. Na de arrestatie, is cardiale functioneel herstel gecontroleerd tijdens opwarmen en reperfusie van het hart met KHB. Wijzigingen in de mate van herstel van cardiale contractiliteit kan worden geëvalueerd om cardioprotectieve cardioprotectie en verschillende strategieën te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vorige protocol gegevens methoden te evalueren myocard prachtige secundair aan wereldwijde ischemie geassocieerd met cardioplegische arrestatie. In onze handen produceert dit protocol een geschatte ~ 40% vermindering van de hartfunctie (LVDP, +/- dP / dt) met minimale veranderingen van de hartslag op de 30 min post-reperfusie tijdstip. Aangezien het hart reperfusie en opgewarmd alle parameters van de hartfunctie verminderd initieel tijdstippen met een sterk verminderde hartslag te stabiliseren tussen 20 en 30 min. C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Cardioplegia Solution (St Thomas II) | Symbol / Concentrations (mM) | ||
| Sodium Chloride | NaCl; 110 | ||
| Potassium chloride | KCl; 16 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.5 | ||
| Magnesium Chloride | MgCL2; 16 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 10 | ||
| Krebs-Heinslet Buffer | |||
| Sodium Chloride | NaCl; 118 | ||
| Potassium Chloride | KCl; 4.8 | ||
| Magnesium Sulfate | MgSO4; 1.7 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 24.9 | ||
| Potassium Phosphate (monobasic) | KH2PO4; 1.2 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.4 | ||
| Sodium Pyruvate | Na pyruvate; 2 | ||
| Glucose | C6H12O6; 6 | ||
| Balloon reagents | |||
| Corn Syrup | |||
| Spaghetti | |||
| Silicon Dispersion Gel | |||
| styrofoam block | |||
| lab oven/incubator ( 50C) | |||
| Langendorff Perfusion equipment | |||
| Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent) | |||
| Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent) | |||
| Heated water circulator | |||
| Cooling water circulator | |||
| Perfusion pump capable of 2-30 ml/min | |||
| Inline perfusion filters – 1 um glass fiber | |||
| Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure | |||
| Small graduated cylinder (~10 mL) | |||
| Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent) | |||
| perfusion resevoir (1L) | |||
| cardioplegia resevoir (~200 mL) | |||
| gas bubbler | |||
| 95/5 O2/CO2 mix | |||
| Surgical tools and reagents | |||
| Metzenbaum and Potz surgical scissors | |||
| two Dumont size 5 forceps | |||
| ketamine | |||
| xylazine | |||
| heparin | |||
| small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends) | |||
| Silk 2-0 and 4-0 sutures |
Riferimenti
- Kloner, R. a., Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104 (24), 2981-2989 (2001).
- Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 290-297 (2011).
- Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127 (1), 41-52 (2010).
- Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79 (2), 609-634 (1999).
- Kloner, R. a., Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97 (18), 1848-1867 (1998).
- Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35 (5), 449-455 (2011).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (11), 867-878 (2003).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1 (101), 1-4 (2011).
- Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39 (1), 194-215 (1998).
- Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300 (5), H1669-H1677 (2011).
- Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).
