Murino modelo de coração isolado de atordoamento do miocárdio Associated com parada cardioplégica
Summary
The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.
Abstract
O protocolo a seguir é útil para avaliar a função cardíaca comprometida ou deslumbrante seguintes insultos isquêmicos moderados do miocárdio. A técnica é útil para a modelagem de lesão isquêmica associada com numerosos fenômeno clinicamente relevantes, incluindo cirurgia cardíaca com parada cardioplégica e circulação extracorpórea, revascularização do miocárdio sem CEC, transplante, angina, isquemia breve, etc. O protocolo apresenta um método geral para modelar hipotérmica parada cardioplégica hipercalêmica e reperfusão em corações de roedores com foco na medição da função contrátil do miocárdio. Em resumo, um coração do rato é perfundido no modo de Langendorff, instrumentada com um balão intraventricular, e parâmetros cardíacos funcionais de linha de base são registados. Após a estabilização, o coração é então sujeito a infusão breve de uma solução de cardioplegia hipotérmica cardioprotetor para iniciar a parada diastólica. Cardioplegia é entregue de forma intermitente ao longo de 2 h. O coração é então reperfundidos e warmed para temperaturas e recuperação da função do miocárdio normotérmicas é monitorada. O uso deste protocolo resulta em função contrátil cardíaca deprimida confiável livre de danos no tecido do miocárdio bruta em roedores.
Introduction
Atordoamento do miocárdio é definido como atividade contrátil reduzida reversíveis apesar da restauração do fluxo de sangue adequado após um breve período de isquemia ou períodos prolongados de insultos isquêmicos com cardioprotection 1,2,3,4,5. O método apresentado é especificamente usado para modelar insultos isquémicos clinicamente relevantes que pode resultar em deficiências na função contráctil reversíveis (ou seja, insultos isquémicos associados com a cirurgia cardíaca utilizando paragem cardioplégica, breves períodos de isquemia, angina, etc). Em contraste com estudos isquemia grave (enfarte do miocárdio, necrose) este protocolo foi desenvolvido para avaliar a recuperação funcional do miocárdio e cardioprotection sem lesão do tecido, remodelação, e morte celular. A maior parte do trabalho discute um protocolo de parada cardioplégica padrão com elementos semelhantes a uma cirurgia cardíaca com hipotermia e entrega cardioplegia intermitente.
Prot miocárdioexão durante a maioria das cirurgias cardíacas depende de cardioplegia e circulação extracorpórea. Embora cardioplegia (CP) soluções e estratégias variam muito (sangue, cristalóide, frio, etc. quente) os elementos mais comuns são: 1) hipercalemia e / ou outras estratégias para prender o coração em diástole, limitando assim a utilização da energia resultante de contração do miocárdio, e 2) a hipotermia para desacelerar o metabolismo e ajudam a manter ATP e outras reservas de energia enquanto preso. Soluções de cardioplegia atuais fornecer proteção para o coração contra insultos isquêmicos que provariam de outra maneira fatal. No entanto, as estratégias de cardioprotetores durante insultos isquêmicos cirúrgicos não são perfeitos, e a lesão isquêmica leve resultante pode resultar em disfunção contrátil cardíaca reversível, apesar de o fluxo sanguíneo adequado (atordoamento do miocárdio), acidose, lesão dos cardiomiócitos, e efeitos vasculares, incluindo diminuição da perfusão coronariana e vasoespasmo.
Este protocolo diferea partir de modelos de isquemia do coração isolado padrão avaliando infarto do miocárdio e isquemia grave na medida em que avalia insultos isquêmicos mais leves que pode resultar em função cardíaca prejudicada seguinte breve isquemia ou insultos isquêmicos associada à parada cardioplégica. (Para revisão sobre técnicas de perfusão de Langendorff e I / R ver estudos 6-8). Para orientações gerais e uma análise aprofundada dos parâmetros experimentais associados com rato corações perfundidos isolados ver Sutherland e t al., 2003 9 A técnica apresentada aqui detalha o equipamento necessário, reagentes, etapas, estratégias e dicas para induzir de forma confiável impressionante em corações do rato. Pequenas modificações são necessárias para aplicar a técnica de ratos.
Resumidamente isolado do rato corações são de Langendorff perfundido durante aproximadamente 30 min, com tampão fisiológica de Krebs-Henseleit (KHB), seguido por paragem cardíaca protegido frio através da entrega de um hypotherm hipercalêmicosolução de cardioplegia ic. Após a detenção, a recuperação funcional cardíaca é monitorada durante o reaquecimento e reperfusão do coração com KHB. As alterações no grau de recuperação da função contráctil cardíaca pode ser avaliada para determinar agentes cardioprotectores e diferentes estratégias de cardioprotecção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os detalhes do protocolo anteriores métodos para avaliar o atordoamento do miocárdio secundário a isquemia global associada à parada cardioplégica. Em nossas mãos este protocolo produz uma redução aproximada de ~ 40% na função cardíaca (LVDP, +/- dP / dt), com alterações mínimas na frequência cardíaca no 30 min pós-reperfusão ponto de tempo. À medida que o coração reperfundido é reaquecido e todos os parâmetros da função cardíaca são reduzidas em pontos de tempo iniciais com um ritmo cardíaco…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Cardioplegia Solution (St Thomas II) | Symbol / Concentrations (mM) | ||
| Sodium Chloride | NaCl; 110 | ||
| Potassium chloride | KCl; 16 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.5 | ||
| Magnesium Chloride | MgCL2; 16 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 10 | ||
| Krebs-Heinslet Buffer | |||
| Sodium Chloride | NaCl; 118 | ||
| Potassium Chloride | KCl; 4.8 | ||
| Magnesium Sulfate | MgSO4; 1.7 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 24.9 | ||
| Potassium Phosphate (monobasic) | KH2PO4; 1.2 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.4 | ||
| Sodium Pyruvate | Na pyruvate; 2 | ||
| Glucose | C6H12O6; 6 | ||
| Balloon reagents | |||
| Corn Syrup | |||
| Spaghetti | |||
| Silicon Dispersion Gel | |||
| styrofoam block | |||
| lab oven/incubator ( 50C) | |||
| Langendorff Perfusion equipment | |||
| Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent) | |||
| Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent) | |||
| Heated water circulator | |||
| Cooling water circulator | |||
| Perfusion pump capable of 2-30 ml/min | |||
| Inline perfusion filters – 1 um glass fiber | |||
| Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure | |||
| Small graduated cylinder (~10 mL) | |||
| Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent) | |||
| perfusion resevoir (1L) | |||
| cardioplegia resevoir (~200 mL) | |||
| gas bubbler | |||
| 95/5 O2/CO2 mix | |||
| Surgical tools and reagents | |||
| Metzenbaum and Potz surgical scissors | |||
| two Dumont size 5 forceps | |||
| ketamine | |||
| xylazine | |||
| heparin | |||
| small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends) | |||
| Silk 2-0 and 4-0 sutures |
Riferimenti
- Kloner, R. a., Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104 (24), 2981-2989 (2001).
- Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 290-297 (2011).
- Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127 (1), 41-52 (2010).
- Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79 (2), 609-634 (1999).
- Kloner, R. a., Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97 (18), 1848-1867 (1998).
- Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35 (5), 449-455 (2011).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (11), 867-878 (2003).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1 (101), 1-4 (2011).
- Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39 (1), 194-215 (1998).
- Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300 (5), H1669-H1677 (2011).
- Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).
