Murin Isolerad Hjärta Modell av Myocardial Fantastisk associerade med kardioplegisk Arrest

Summary

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Abstract

Följande protokoll är till nytta för utvärdera nedsatt hjärtfunktion eller hjärt fantastiska följande moderata ischemiska förolämpningar. Tekniken är användbar för modellering ischemisk skada i samband med ett stort antal kliniskt relevant fenomen inklusive hjärtkirurgi med kardioplegiska gripande och hjärt-bypass, off-pump CABG, transplantation, angina, kort ischemi, osv. Protokollet visar en generell metod för att modellera hypotermi hyperkalemisk kardioplegiska gripande och reperfusion i gnagare hjärtan med fokus på mätning av hjärtmuskelsammandragningsfunktion. I korthet, en mus hjärta perfusion i Langendorff läge, instrumenterade med en intraventrikulär ballong, och initial hjärt funktionella parametrar registreras. Efter stabilisering, är hjärtat sedan föremål för korta infusion av en hjärtskyddande hypotermisk kardioplegilösning att inleda diastoliskt stillestånd. Kardioplegi levereras intermittent över 2 timmar. Hjärtat sedan reperfuseras och warmed till normotermisk temperaturer och återvinning av hjärtmuskelfunktionen övervakas. Användning av detta protokoll resulterar i tillförlitlig deprimerad hjärtsammandragningsfunktion fri från grov myocardial vävnadsskada hos gnagare.

Introduction

Myokardial bedövning definieras som reversibel minskad kontraktil aktivitet trots återställning av tillräckligt blodflöde efter en kort period av ischemi eller utdragna perioder av ischemiska skador med kardioprotektion ^1,2,3,4,5. Den metod som presenteras är specifikt används för att modellera kliniskt relevanta ischemiska förolämpningar som kan resultera i reversibla försämringar i kontraktil funktion (dvs ischemiska förolämpningar i samband med hjärtkirurgi utnyttjar kardioplegisk stillestånd, korta perioder av ischemi, angina, etc.). I motsats till svåra ischemi studier (hjärtinfarkt, nekros) detta protokoll har utvecklats för att utvärdera hjärtinfarkt funktionell återhämtning och kardioprotektion utan vävnadsskada, ombyggnad, och celldöd. Majoriteten av uppsats diskuterar en standard kardioplegisk gripande protokoll med element liknande en hjärtkirurgi med användning hypotermi och intermittent kardioplegi leverans.

Myokardiell protvsnitt under större delen av hjärtoperationer förlitar sig på kardioplegi och hjärt-bypass. Även kardioplegi (CP) lösningar och strategier varierar kraftigt (blod, kristalloid, kallt, varmt etc.) de vanligaste elementen är 1) hyperkalemi och / eller andra strategier för att arrestera hjärtat i diastole, vilket begränsar energiutnyttjande till följd av hjärtmuskelsammandragning, och 2) hypotermi att bromsa ämnesomsättning och bidra till att upprätthålla ATP och andra energireserver medan greps. Nuvarande kardioplegi lösningar ger skydd till hjärtat mot ischemiska förolämpningar som annars skulle visa sig dödliga. Men hjärtskyddande strategier under kirurgiska ischemiska förolämpningar är inte perfekt, och den resulterande mild ischemisk skada kan leda till reversibel hjärtsammandragnings dysfunktion trots adekvat blodflöde (hjärtinfarkt bedövning), acidos, cardiomyocyte skador och kärleffekter inklusive minskad koronar perfusion och vasospasm.

Detta protokoll skiljer sigfrån vanliga isolerade hjärtischemimodeller utvärderar hjärtinfarkt och svår ischemi genom att den utvärderar mildare ischemiska förolämpningar som kan leda till nedsatt hjärtfunktion efter kort ischemi eller ischemiska förolämpningar i samband med kardioplegisk stillestånd. (För granskning på Langendorff perfusion tekniker och I / R studier se ^{6 – 8).} För allmänna riktlinjer och en grundlig analys av experimentella parametrar i samband med mus isolerade perfunderade hjärtan se Sutherland e t al. 2003 ⁹ Tekniken presenteras här detaljer nödvändig utrustning, reagenser, steg, strategier och tips för att på ett tillförlitligt sätt framkalla bedövning i mus hjärtan. Mindre modifieringar är nödvändiga för att tillämpa tekniken till råttor.

I korthet isolerade mus hjärtan är Langendorff perfunderades under ca 30 min med fysiologisk Krebs-Henseleit-buffert (KHB), följt av kall skyddade hjärtstillestånd genom tillförsel av en hyperkalemisk hypothermic kardioplegilösning. Efter gripandet, är hjärt funktionell återhämtning övervakas under återuppvärmning och reperfusion av hjärtat med KHB. Förändringar i graden av återvinning av hjärtsammandragningsfunktionen kan utvärderas för att bedöma hjärtskyddande medel och olika hjärtskyddande strategier.

Protocol

OBS: Alla förfaranden godkändes av livslängden Institutional Animal Care och användning kommittén och alla djur och förfaranden i enlighet med National Research Council Guide för skötsel och användning av försöksdjur 10. 1. Ballong Fabrication och vänsterkammartryckövervakning Circuit Konstrukt LV ballonger enligt Miller et al., 11 I en bägare med en omrörarstav, blanda 9,5 ml destillerat vatten, 14,2 ml ljus majssirap och 33,8 g sacka…

Representative Results

Figur 1 visar typiska resultat från ett mus-experimentet. LVP (röd linje), dP / dt (grön linje), och temperaturen (lila linje) var continusouly noterats under ~ 3 timmar. Bokstäver indikerar – baslinjemätning, b, c, d, e – leverans av kardioplegilösning, f – inledningen av reperfusion, g, h, i, j – mätning av cornary flöde under reperfusion. Obs, deprimerad LVDP och dP / dt vid reperfusion jämfört med baseline. Figur 1B innehåller data från en inspelad över ~ 2 sek. Observe…

Discussion

De föregående protokollinformation metoder för att utvärdera hjärtinfarkt fantastiska sekundärt till global ischemi i samband med kardioplegisk stillestånd. I våra händer detta protokoll ger en ungefärlig ~ 40% minskning av hjärtfunktionen (LVDP, +/- dP / dt) med minimala förändringar i hjärtfrekvens vid 30 min efter reperfusion tidpunkt. Eftersom hjärtat är reperfuseras och rewarmed alla parametrar för hjärtfunktionen reduceras vid initial tidpunkter med en kraftigt reducerad hjärtfrekvens innan stab…

Materials

Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters – 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures