Ein<em> Ex-vivo-</em> Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren
Summary
Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert.
Abstract
Das Studium der Hormonwirkung in der menschlichen Brust durch Mangel an geeigneten Modellsystemen behindert. Bei der In-vitro-Kultur, Grund Brustepithelzellen neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression zu verlieren. Weit verbreitete Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs-Zelllinien sind von begrenzter Relevanz für die in vivo-Situation. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren. Frische menschlichem Brustgewebe Proben aus chirurgischen Ablagematerial wie Reduktion mammoplasties oder mammectomies mechanisch und enzymatisch verdaut, um Gewebefragmente, die Kanäle und Läppchen und mehrere Stroma-Zelltypen zu erhalten. Diese Gewebemikrostrukturen in Basismedium ohne Wachstumsfaktoren gehalten bewahren ihre interzellulären Kontakte, die Gewebearchitektur und bleiben Hormon für einige Tage reagiert. Sie sind ohne weiteres für RNA- und Proteinextraktion, histologische Analyse bearbeitet oder in Gefriermedium gespeichert. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet, um spezifische Zellpopulationen anzureichern. Dieses Protokoll bietet eine einfache, Standardansatz für die translationale Studien mit sehr komplexen, vielfältigen menschlichen Proben.
Introduction
Informationen über die Mutations Landschaft in Brustkrebs ist in hohem Tempo zu. Weniger Aufmerksamkeit wurde auf systemische Faktoren, die die Entstehung von Brustkrebs beeinflussen bezahlt worden. Die Exposition gegenüber Fortpflanzungshormone hat einen großen Einfluss auf den Krankheitsverlauf 1-3. Dennoch sind die Mechanismen, durch die Fortpflanzungshormone treffen auf die menschliche Brust kaum verstanden. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mausmodellen hat ergeben, dass sie Zell intrinsische und parakrine Signal durch mehrere Effektoren 4 einzubeziehen.
Die begrenzte Wissen über die Hormonwirkung in der menschlichen Brust ist vor allem auf das Fehlen angemessener Modelle. Die meisten arbeiten auf die Mechanismen der Östrogenrezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PR) Signalisierung Hormonrezeptor-positiven Brustkrebszelllinien, wie zum Beispiel MCF-7 und T47D geführt. Diese wurden aus Pleuraergüsse von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs, die alrea hatte abgeleitetdy erhielt mehrere Behandlungen 5. Die biologische Relevanz der Ergebnisse in einer solchen einfachen in vitro-Modellen der menschlichen Brust ist fragwürdig und Zielgene in diesen in vitro-Modellen identifiziert sind unterscheiden sich von Zielgenen, die in Tiermodellen 6 identifiziert. Beim primären menschlichen Brust Epithelzellen in vitro kultiviert werden sie neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression und damit Hormonantwort 7,8 verlieren. Dieses Problem kann durch anspruchsvolle 3D-Ansätze mit Matrigel circumventd werden. Auf diese Weise, C. Clarke und Mitarbeitern gelang Festlegung Brustepithelzellen die Hormon-Rezeptor-Expression erhalten und zeigte eine proliferative Reaktion auf Progesteron Stimulation 9. Noch zwei in vivo Progesteronrezeptorzielgene wichtig, Wnt-4 und RANKL, wurden nicht von Progesteron Stimulation in diesem System 9 induziert. Dieser Ansatz wurde kürzlich weiter mit in vitro genommen </em> Hormonvorbehandlung und RANKL Induktion 10 erreicht. Ein Vorbehalt bleibt, dass Matrigel hat Aktivitäten, die chargenabhängig sind, ist teuer und erfordert eine Versuchsanordnung, die geeignet sind für kleine Zahlen nur Zelle ist.
Basierend auf der Erkenntnis, dass in vivo ER und PR-Signalisierung werden weitgehend durch parakrine Interaktion 11 vermittelten wir argumentiert, daß die intrazellulären Wechselwirkungen beibehalten werden müssen. Ein weiterer wichtiger Faktor, der als Gewebe verloren werden, um einzelne Zellen zur in vitro Kultur dissoziiert sind die Wechselwirkungen der Epithelzellen mit der extrazellulären Matrix; doch diese sind entscheidend für die epitheliale Differenzierung und ihre Störung ist in der Tumorgenese 12 wichtig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, um Brustgewebe Mikrostrukturen aus frischen chirurgischen Ablagematerial 13 zu isolieren. Das Brustdrüsengewebe, bestehend aus einem zweischichtigen Epithel mit inneren und äußeren Lumen myoepithelial Zellen wird von Fettgewebe präpariert und in mechanische und enzymatische Dissoziation unterworfen. Nach dem Waschen und Zentrifugation werden Fragmente der Milchgänge erhalten, die auf enger Interaktion mit vielen Stromazellen behalten. Diese Gewebemikrostrukturen bleiben Hormon reagieren. Das Modell wurde in klinischen Proben 13 validiert. Als solches kann das vorliegende Verfahren dazu beitragen, die Hormonwirkung in der Brust in einem biologisch und klinisch relevanten Kontext zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene ex vivo Kultur vorsieht Brustgewebe Mikro enthaltende intakte Kanäle und Läppchen, zusammen mit anderen Zelltypen, die normalerweise im menschlichen weiblichen Brust gefunden. Bei der Verarbeitung des menschlichen Brustgewebe gewöhnlich durch Reduktion mammoplasties erhalten, Entfernung von Fettgewebe, mechanische und enzymatische Verdauung des Stromamatrix und Lyse roter Blutkörperchen reichert Milchkanal Fragmente und Klemmen duktalen lobulären Einheiten. Gentle enzymatische Verdauung an…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken M. Fiche von Universitätsspital Lausanne für die Bereitstellung der mammoplasty Foto, M. Wirth und A. Ayyanan der Schweizerischen Institut für Experimentelle Krebsforschung, National Center of Competence in Research Molekulare Onkologie, School of Life Sciences, Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne für die technische Unterstützung und R. Clarke der Universität Manchester für Kritik. Die Forschung, die diese Ergebnisse Unterstützung SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, und die Initiative Innovative Arzneimittel gemeinsames Unternehmen gemäß Finanzhilfevereinbarung erhalten hat, nicht. 115.188, Ressourcen, von denen der Finanzbeitrag aus dem Siebten Rahmenprogramm der EU (FP7 / 2007-2013) und European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations Unternehmen in Sachleistungen bestehen. Die Web-Adresse der Initiative Innovative Arzneimittel ist http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
Riferimenti
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