איתור של Exosomal ביומרקר על ידי שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM)
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
Exosomes הם מבני microvesicular שמשחקים תפקיד מתווך בתקשורת בין תאית. זה עניין ללמוד את המטען הפנימי של exosomes כדי לקבוע אם הם נושאים סמנים ביולוגיים מפלים מחלה. לביצוע ניתוח exosomal, יש צורך לפתח שיטה להפקת וניתוח exosomes מbiofluids היעד מבלי לפגוע בתוכן הפנימי.
שחרור חשמלי הנוצר על-שדה והמדידה (EFIRM) הוא שיטה לחילוץ במיוחד exosomes מbiofluids, לפרוק את מטענם, ובדיקת תוכן RNA / החלבון הפנימי שלהם. באמצעות microparticle נוגדן אנטי אנושי CD63 הספציפי מגנטי, exosomes הם זירז ראשון מbiofluids. החילוץ הבא, גלי מתח נמוך חשמליים מחזוריים מרובעים (CSW) מיושמים לשבש את קרום לפוחי ולגרום לפריקת מטען. התוכן של exosome הוא הכלאה לפריימרים DNA או נוגדנים משותקים על פני האלקטרודה לקואהntification של תוכן מולקולרי.
שיטת EFIRM יש יתרון להפקת exosomes ומטען פורק לניתוח ללא חיץ תמוגה. שיטה זו היא מסוגלת לבצע זיהוי ספציפי של שני מטרות RNA וחלבון סמן ביולוגי בexosome. EFIRM תמציות exosomes במיוחד המבוסס על סמני פני השטח שלהם בניגוד לטכניקות המבוסס על גודל.
במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) וassay להדגים את הפונקציונליות של השיטה עבור לכידת exosome וניתוח. שיטת EFIRM הייתה מוחלת על exosomal ניתוח של 9 עכברים הוזרקו תאי H640 סרטן ריאות אנושיות (שורת תאי transfected להביע את סמן exosome CD63-GFP אדם) על מנת לבדוק את פרופיל exosome נגד 11 עכברים שקבלו בקרות מלוחה. רמות הגבוהות של סמנים ביולוגיים exosomal (GAPDH גן ההתייחסות וסמן פני חלבון האנושי CD63-GFP) נמצאו עבור H640 הזריק עכברים בשתי דגימות הסרום ורוק. יתר על כן, saliva ודגימות סרום הוכיחו שיש ליניאריות (R = 0.79). תוצאות אלה מרמזות ליכולת הקיום של סמנים ביולוגיים exosome רוק לגילוי המחלות דיסטלי.
Introduction
מחקר Exosome הוא תחום מתפתח של חקירה הבוחן microvesicles שומנים שנושאים 1 RNA, DNA 2, וחלבון 3 מטענים. חקירות קודמות של הביולוגיה exosome הובילו לזיהוי של exosomes בbiofluids כגון דם 4, 5 שתן, שד חלב 6, ורוק 7. מחקרים הוכיחו כי exosomes לשחק תפקיד במסלולים סלולריים שונים, מרחוק המדיטציה תקשורת בין מערכות הגוף שונות 8. בגלל התפקיד exosomes לשחק בתקשורת בין תאית, זה השערה הוא שהם עשויים לארוז מטרות biomolecule (חלבון, RNA, ו- DNA) מתואמות עם מצבי מחלה. במבחנה 3 ובעלי חי מודל 9 מחקרים מופיעים לאשש השערה זו. בחקירת תוכן exosomal לגילוי סמן ביולוגי, יש צורך לפתח מתודולוגיה לבידוד exosome סלקטיבית מbiofluids expulsi המושרה,על מטענים מexosomes, וכימות של מולקולות ביולוגיות exosome. במידה על עבודה זו, exosomes יוגדר כמבנה בעל קוטר של כ 70-100 ננומטר והוא בעל CD63 סמן משטח.
חוקרים בדרך כלל לטהר ראשון exosomes ידי ultracentrifugation 10 ולאחר מכן לעבד תוכן exosomal באמצעות השימוש בערכות מאגר תמוגה. שימוש בשיטות מאגר תמוגה דורשת פעמים דגירה נעות בין כמה דקות לכמה שעות. תהליך זה עשוי לגרום הניזק למטען exosome ולהוביל לטעום השפלה. לדוגמא, RNA exosome רוק שוחרר באמצעות מאגר תמוגה לסביבת חוץ-התאית המקיפה בעל זמן מחצית חיים של מתחת 1 דקות, מה שהופך את המדידה של RNA exosomal פוסט-תמוגה חיץ משימה קשה במיוחד ללא התוספת של חומרים כימיים ייצוב 11. ההשפעה מורכבת של הוספת חומרים כימיים שונים לתמוגה וייצוב עשויה להציג את הסוכנים שלסבך ולהפריע לanalysis של תוכן exosomal. גישה חלופית עשויה להיות מועילה למהירות פריקת תוכן exosomal ושמירה על המטען לאפיון בצורה בטוחה.
בעבודה זו, אנו מציעים את השימוש בשדה חשמלי לא אחיד לשחרורו של תוכן exosomal. חשמליים-שדות כבר ידועים לשאת את היכולת לקטב ולשבש את bilayer השומנים שיוצר קרום תא. העבודה הניסויית שלנו בוחנת שימוש בגלים מרובעים מחזוריים לא אחידים (CSW) לשיבוש מבנה microvesicle של exosomes ושחרור מטען בוצע. שיטה זו משתמשת במתחים בטווח מאה millivolt כמה, מה שאומר שרוב המולקולות ביולוגיות לא תופרענה. אנו מראים כי השימוש בגל מחזורי מרובע הוא מסוגל להניע שחרורו של תוכן mRNA exosome הרוק לסביבת fluidic שמסביב. גרסה זו של תוכן exosomal משולבת בצורה חלקה עם מערכת אלקטרודה שיכול לשמש כדי לכמת את רמות ביטוי הסמן הביולוגי 12,13. שיטה מוצעת זו מאפשרת ולניתוח מהירים, רגישים, מאגר תמוגה ללא תוכן exosome.
איור 1. סקירה כללית של EFIRM Workflow.. שיטת EFIRM מחולקת באופן כללי לשלושה שלבים עיקריים הנדרשים לטיהור וexosomes ניתוח.
שיטת תוכן exosomal שחרור וניתוח זה CSW מבוסס משמשת יחד עם microbeads המגנטי CD63 הספציפי לבידוד exosome. חרוזים CD63-זיקה אלה מאפשרים לבידוד סלקטיבי של exosomes מדגימות רוק (וbiofluids האחר). לאחר דגירה והפקת exosomes באמצעות חרוזים מגנטיים, החרוזים היגרו למערכת החיישנים אלקטרוכימיים לCSW תוכן שחרור וחלק ניתוח של הניסוי מבוסס. איור 1 נותן סקירה כללית של העבודהזרימה של שיטת EFIRM.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאחר שהתוצאות מצביעות, חלקיקים מגנטיים CD63 אנטי אנושי מצופה יכולים ללכוד חלקיקים קטנים במיוחד שיש לי גודל הנע 70-100 ננומטר. חלקיקים שנתפסו זה עולה בקנה אחד עם הפרופיל שנצפה קודם לכן של exosomes. יתר על כן, השימוש בCSW המתח הנמוך בעקבות לכידתו של החלקיקים מוצג כדי להסיר אותם ממ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר והמרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, המכונים לאומי לבריאות, דרך גרנט UL1TR000124 (לFW); פליקס ומילדרד ייפ נתרמו Professorship וקרן משפחת בארנס (לDTWW), המכון הלאומי למחקר דנטלי וCraniofacial של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס T90DE022734 (לMT). התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
Riferimenti
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
