Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Exossomos são estruturas microvesicular que desempenham um papel de mediação na comunicação intercelular. É de interesse para o estudo da carga interna de exossomos para determinar se eles são portadores da doença biomarcadores discriminatórias. Para a realização de análise exosomal, é necessário desenvolver um método para a extracção e análise de exossomas a partir de fluidos biológicos alvo sem danificar o conteúdo interno.

Libertação eléctrica induzida por campo e medição (Efirm) é um método para a extracção especificamente exossomas a partir de fluidos biológicos, descarregar as suas cargas, e testando o seu conteúdo de ARN / proteína interna. O uso de um anticorpo CD63 específico de micropartículas magnética anti-humana, exossomos são primeiro precipitado a partir de fluidos biológicos. Após a extracção, de baixa tensão ondas quadradas eléctricas cíclicos (CSW) são aplicados para romper a membrana vesicular e causar o descarregamento da carga. O conteúdo do exossoma é hibridado com iniciadores de ADN ou de anticorpos imobilizados numa superfície de eléctrodo para quantification de teor molecular.

O método Efirm é vantajoso para a extracção de exossomas carga e descarga para análise sem tampão de lise. Este método é capaz de efectuar a detecção específica de ambos os alvos de ARN e proteína de biomarcadores na exossoma. Efirm extrai exossomas especificamente com base nos seus marcadores de superfície, em oposição a técnicas baseadas em tamanho.

A microscopia electrónica de transmissão (TEM) e ensaio de demonstrar a funcionalidade do método de captura e análise de exossoma. O método foi aplicado para Efirm exosomal análise de 9 ratinhos injectados com células de pulmão humano H640 do cancro (uma linha de células transfectadas para expressar o marcador CD63 humano exossoma-GFP), a fim de testar o seu perfil contra exossoma 11 ratinhos que receberam controlos de solução salina. Níveis elevados de biomarcadores exosomal (GAPDH gene de referência e proteína de superfície do marcador CD63 humano-GFP) foi encontrado com o H640 injetaram em ratos em ambas as amostras de soro e saliva. Além disso, saliva e amostras de soro foram demonstradas ter linearidade (R = 0,79). Estes resultados são sugestivos para a viabilidade de biomarcadores de exossoma salivares para a detecção de doenças distais.

Introduction

Pesquisa exosome é um campo emergente de investigação que examina microvesículas lipídicas que carregam ^um RNA, DNA ^{2, 3} e proteína de carga. Inquéritos anteriores da biologia exosome levaram a identificação de exossomos em fluidos biológicos como sangue ^{4, 5} urina, leite materno ^{6, 7} e saliva. Estudos têm demonstrado que os exossomas desempenhar um papel em diferentes vias celulares, meditar remotamente a comunicação entre diferentes sistemas do corpo ^8. Devido ao papel exossomas desempenhar na comunicação intercelular, é a hipótese de que eles podem empacotar alvos biomoleculares (proteína, RNA e DNA) correlacionados com estados de doença. ³ in vitro e animal modelo ⁹ estudos parecem confirmar esta hipótese. Ao investigar o conteúdo exosomal para descoberta de biomarcadores, é necessário o desenvolvimento de uma metodologia para o isolamento exosome seletiva de fluidos biológicos, expulsi induzidona carga a partir de exossomas, e quantificação de biomoléculas de exossoma. No âmbito do presente trabalho, os exossomas irá ser definido como uma estrutura com um diâmetro de cerca de 70-100 nm e que possui marcador de superfície CD63.

Os investigadores tipicamente primeiro purificar os exossomas por ultracentrifugação ^{a 10} e, em seguida, processar o conteúdo exosomal através do uso de kits de tampão de lise. O uso de métodos de tampão de lise requer tempos de incubação variam de minutos a horas. Este processo pode potencialmente prejudicar carga exosome e levar para provar degradação. Por exemplo, o ARN exossoma salivar libertado através de tampão de lise para o ambiente extracelular circundante possui uma semi-vida de menos de 1 min, tornando a medição de ARN exosomal pós-tampão de lise uma tarefa particularmente difícil sem a adição de reagentes de estabilização ^11. O efeito combinado da adição de vários reagentes para lise e estabilização podem introduzir agentes que complicam e interferir com a Analysis de conteúdo exosomal. Uma abordagem alternativa pode ser útil para uma rápida descarga conteúdo exosomal e preservar a segurança da carga para caracterização.

Neste trabalho, propomos o uso de um campo elétrico não uniforme para a liberação de conteúdo exosomal. Elétrico-campos foram conhecidos para levar a capacidade de polarizar e perturbar a bicamada lipídica que forma as membranas celulares. Nosso trabalho experimental explora o uso de não-uniformes cíclicos ondas quadradas (CSW) para interromper a estrutura microvesículas de exossomos e liberando a carga transportada. Este método utiliza tensões na faixa de várias centenas de milivolts, o que significa que a maioria das biomoléculas não será interrompido. Nós demonstramos que o uso de uma onda quadrada-cíclico é capaz de accionar o conteúdo lançamento de ARNm salivar exossoma no ambiente circundante fluídica. Esta versão do conteúdo exosomal está perfeitamente integrado com um sistema de eletrodos que podem ser usados ​​para quantificar os níveis de expressão de biomarcadores ^12,13. Este método proposto permite, e tampão de lise análise livre rápido, sensível do conteúdo exosome.

Figura 1. Visão Geral do Efirm ^Workflow.. O método Efirm é dividida em três fases principais que são necessários para a purificação e análise de exossomos.

Este método de libertação conteúdo exosomal e análise baseada CSW é usado em conjunto com microesferas magnéticas específicos de CD63 para isolamento exossoma. Estes grânulos de CD63 por afinidade para permitir o isolamento selectivo de exossomas a partir de amostras salivares (e outros fluidos biológicos). Após a incubação e extração de exossomos usando as esferas magnetizadas, as contas são migrados para o sistema de sensor eletroquímico para a CSW baseado liberação de conteúdo e análise de parte do experimento. A Figura 1 apresenta uma visão geral do trabalhofluir do método Efirm.

Protocol

1. magnética baseado no grânulo exossomo Extracção Pipetar uma solução bem agitada de 5 mL de micropartículas magnéticas revestidas de estreptavidina em 495 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), tampão num tubo de microcentrífuga para ressuspender as esferas. Lavar e ressuspender as esferas com 500 ul de PBS três vezes usando uma cremalheira magnética. A cremalheira é uma matriz de magnetos na parte lateral de uma unidade de alojamento, que pode prender os tubos de amostra de microc…

Representative Results

Validação de exossomo Captação de contas usando TEM Isolamento de exossomos de saliva usando CD63 esferas magnéticas anti-humanos foi validado seguindo o protocolo de extração, utilizando imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET). TEM mostra esferas magnéticas com grânulos 70-100 nm imediatamente adjacentes (ver Figura 3A, 3B e), de acordo com o perfil conhecido de exossomos. Não foram observados grânulos de 70-100 nm para as esfera…

Discussion

Como os resultados indicam, CD63 anti-humano revestido nanopartículas magnéticas são capazes de capturar especificamente pequenas partículas que têm um tamanho que varia 70-100 nm. Esta partícula capturado é consistente com o perfil observado anteriormente de exossomas. Além disso, o uso da CSW baixa voltagem após a captura das partículas é mostrado para removê-los da superfície do grânulo e provocar perfis de degradação de ADN semelhante ao de um método tradicional de tampão de lise com base para a li…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532