Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Exosomer er microvesicular strukturer, der spiller en rolle som mægler intercellulære kommunikation. Det er af interesse at studere den interne last af exosomer at afgøre, om de bærer sygdoms diskriminerende biomarkører. Til udførelse exosomal analyse er det nødvendigt at udvikle en metode til ekstraktion og analyse af exosomer fra target Biofluids uden at beskadige den interne indhold.
Elektrisk felt-induceret frigivelse og måling (EFIRM) er en metode til specifikt at udtrække exosomer fra Biofluids, losse deres last, og teste deres interne indhold RNA / protein. Anvendelse af et anti-humant CD63-specifikt antistof magnetisk mikropartikel er exosomer først udfældet fra Biofluids. Efter ekstraktion lav spænding elektriske cykliske firkantede bølger (CSW) anvendes til at forstyrre den vesikulær membran og forårsage losning gods. Indholdet af exosomet hybridiseres til DNA-primere eller antistoffer immobiliseret på en elektrode overflade til quantification molekylær indhold.
Den EFIRM fremgangsmåde er fordelagtig til ekstraktion af exosomer og losning lasten til analyse uden lysisbuffer. Denne metode er i stand til at udføre specifik påvisning af både RNA og protein biomarkør mål på exosomet. EFIRM ekstrakter exosomer specifikt baseret på deres overflademarkører i modsætning til størrelse teknikker.
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og assay påvise funktionaliteten af fremgangsmåden til exosom opsamling og analyse. Den EFIRM metode blev anvendt til exosomal analyse af 9 mus injiceret med human lung cancer H640 celler (en cellelinie transficeret til at udtrykke exosomet markør human CD63-GFP) for at teste deres exosome profil mod 11 mus, der modtog saltvand kontrol. Forhøjede niveauer af exosomal biomarkører (henvisning gen GAPDH og protein overflademarkør human CD63-GFP) blev fundet for H640 injicerede mus i både serum og spytprøver. Endvidere SallVA og serumprøver blev påvist at have linearitet (R = 0,79). Disse resultater er tankevækkende for levedygtighed spyt exosom biomarkører til detektering af distale sygdomme.
Exosome forskning er en nye inden for undersøgelse, der undersøger lipid mikrovesikler der bærer RNA 1, DNA 2, og protein 3 last. Tidligere undersøgelser af exosom biologi har ført til identifikation af exosomer i Biofluids såsom blod 4, urin 5, modermælk 6, og spyt 7. Undersøgelser har vist, at exosomer spiller en rolle i forskellige cellulære veje, fjernt meditere kommunikation mellem forskellige systemer i kroppen 8. På grund af den rolle exosomer spille i intercellulære kommunikation er det en hypotese, at de kan pakke biomolekylære mål (protein, RNA og DNA) korreleret med sygdomstilstande. In vitro 3 og dyremodel 9 undersøgelser synes at bekræfte denne hypotese. Ved at undersøge exosomal indhold til biomarkør opdagelse, er det nødvendigt at udvikle en metode til selektiv exosom isolation fra Biofluids, induceret expulsipå af gods fra exosomer, og kvantificering af exosom biomolekyler. I omfanget af dette arbejde, vil exosomer defineres som en struktur, der har en diameter på ca. 70-100 nm og besidder overflade markør CD63.
Forskere typisk først rense exosomer ved ultracentrifugering 10 og så behandle exosomal indhold gennem brugen lysisbuffer kits. Anvendelse lysisbuffer metoder kræver inkubationstider i området fra minutter til timer. Denne proces kan potentielt skade exosom fragt og føre til prøve nedbrydning. For eksempel spyt exosome RNA frigivet via lysis buffer i det omgivende ekstracellulære miljø har en halveringstid på under 1 minut, hvilket gør måling af exosomal RNA post-lysepuffer en særlig vanskelig opgave uden tilsætning af stabiliserende reagenser 11. Den sammensatte virkning af tilsætning af forskellige reagenser til lysis og stabilisering kan indføre midler, der komplicerer og interfererer med anasis af exosomal indhold. En alternativ fremgangsmåde kan være nyttige for hurtigt losning exosomal indhold og sikkert bevare lasten til karakterisering.
I dette arbejde, foreslår vi brugen af en ikke-ensartet elektrisk felt for frigivelse af exosomal indhold. Elektriske felter er kendt for at bære evnen til at polarisere og forstyrre lipiddobbeltlag, der danner cellemembraner. Vores eksperimentelle arbejde udforsker brugen af uensartede cykliske firkantede bølger (CSW) for at forstyrre mikrovesikel struktur exosomer og frigivelse gennemført fragt. Denne metode anvender spændinger i flere hundrede millivolt interval, hvilket betyder, at de fleste biomolekyler ikke vil blive afbrudt. Vi viser, at brugen af en cyklisk-firkantbølge er i stand til at aktivere frigivelsen af spyt exosome mRNA indhold i det omgivende fluide miljø. Denne udgave af exosomal indhold er integreret med en elektrode, der kan bruges til at kvantificere biomarkør ekspressionsniveauer 12,13.. Den foreslåede metode giver mulighed for hurtig, følsom, og lysis buffer gratis analyse af exosome indhold.
Figur 1. Oversigt over EFIRM Workflow.. The EFIRM metode groft inddeles i tre hovedfaser, der er nødvendige til rensning og analyse exosomer.
Denne CSW baseret exosomal indhold frigivelse og analysemetode bruges sammen med CD63-specifikke magnetiske mikroperler til exosome isolation. Disse CD63-affinitetsperler mulighed for selektiv isolering af exosomer fra spyt prøver (og andre kropsvæsker). Efter inkubering og ekstraktion af exosomer under anvendelse af de magnetiserede perler, er perlerne migreret til den elektrokemiske sensor system for CSW baseret indhold frigivelse og analyse del af forsøget. Figur 1 giver en oversigt over det arbejde,flow af EFIRM metoden.
Som resultaterne indikerer, anti-human CD63 coatede magnetiske nanopartikler er i stand til specifikt at fange små partikler, der har en størrelse i intervallet fra 70 til 100 nm. Dette fanget partikel er i overensstemmelse med den tidligere observerede profil exosomer. Desuden er brugen af lav spænding CSW efter indfangning af partiklerne vist at fjerne dem fra perleoverfladen og forårsage DNA-nedbrydning profiler svarende til en traditionel metode lysepuffer til fragt frigivelse. Disse data tyder på, at arb…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Center for Research Resources og National Center for Fremme Translationelle Sciences, National Institutes of Health, gennem Grant UL1TR000124 (til FW); Felix & Mildred Yip Begavet professorat og Barnes Family Fund (til DTWW), National Institute of Dental & Craniofacial Research af National Institutes of Health under Award Number T90DE022734 (MT). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |