Transposon מתווך האינטגרציה של פלסמיד דנ"א לתוך אזור Subventricular של עכברים בילוד ליצירת מודלים חדשניים של גליובלסטומה
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
multiforme גליובלסטומה (GBM) הוא (60%) הגידול הנפוץ ביותר העיקרי המוח במבוגרים, עם חציון הישרדות של 15-21 חודשים, כאשר טופל בניתוח, הקרנות, וכימותרפיה 1. טיפולים חדשניים לGBM הם הכרחיים. טיפולים ניסיוניים דורשים בדיקה במודלים של בעלי חיים שכראוי לשחזר את המאפיינים הבולטים של המחלה האנושית. אסטרטגיות כדי לגרום GBM במכרסמים כוללים mutagenesis הכימי עם סוכני אלקילציה, בתאי מין או שינויים גנטיים סומטיים, או השתלה באמצעות תא גליומה קווים 2. הנפוץ ביותר המודלים להעסיק את ההשתלה של שורות תאי גליומה, או orthotopically, למוח או תת עורי באמצעות תאי syngeneic בבעלי חיים עם גנוטיפ הזהה; או תאי xenogeneic, קווים הנפוצים ביותר אדם GBM תא, שהושתלו בעכברים חיסוניים חלש 3. Xenografts מציע יתרונות רבים למחקר של גידולים תוך-גולגולתי: נוחות של שחזור, standaשיעורי rdized צמיחה, זמן של לוקליזציה מוות וגידול. עם זאת, יש לי מודלים אלה מגבלות בשל הגישה המלאכותית, פולשני כירורגי המשמשת להשתלות ויכולת מוגבלת לשחזר במדויק היסטולוגית כולל מאפיין של GBM האנושי (IV הכיתה WHO): נמק פסאודו-pallisading, atypias הגרעיני, פלישה מפוזרת, ריבוי מיקרו-וסקולרית והיווצרות של כלי דם glomeruloid חריגות 4-7. אינדוקציה של GBM על ידי שינוי הגנום של תאים סומטיים עם DNA שעור, או עם וקטורים ויראליים 8-12, או עם שילוב בתיווך transposon 13, מתרבה באופן הדוק יותר אטיולוגיה של מחלות בבני אדם ומשחזרת תכונות histo-פתולוגי של GBM האנושי.
מבחינה הסטורית, גידולים של מערכת העצבים המרכזית שמאורגנים על בסיס התא הנתפס של מקור, שבו נצפה, יהיה גורם מנבא להישרדות 14. GBMs מסווג ליסודי ותיכוני. טוד ראיות המתעורריםאיי מצביע על אופי הטרוגני מאוד של גליובלסטומה העיקרית 15. GBM המשני (15%), כתוצאה משינוי הממאיר של astrocytomas הנמוך כיתה (WHO אני כיתה) וastrocytomas anaplasic (WHO כיתה II), המשויכים תחילת מוקדמת של המחלה, הפרוגנוזה טובה יותר ודפוס "proneural" של ביטוי גנים , ואילו GBM הראשוני (85%) מראה תחילת סוף, הפרוגנוזה וגליה (קלסית) עלובות, עצבית או דפוסי ביטוי mesenchymal. אם דפוסי ביטוי גנים אלה לתאם עם התא בפועל המוצא של הגידול הוא עדיין נחקר באופן פעיל. צבירת נתונים מראה כי השילוב של מוטציות גנטיות הקשורות לGBMs מנבא להישרדות. לדוגמא, אובדן heterozygocity (LOH) של כרומוזומים 1p / 19q, מוטציות IDH1, amplifications PDGFRα, המשויכים GBMs המשני, דפוס ביטוי proneural ופרוגנוזה טובה יותר, ואילו EGFR ביטוי היתר, Notch והפעלת מסלול קיפוד סוניק, NFאובדן ומוטציות של p53 1 וPTEN מתואמים עם עצבי, קלאסי, או GBM הראשוני mesenchymal ופרוגנוזה גרועה 16,17. כניסתו של פרויקטים לקביעת רצף בקנה מידה גדולים וההצטברות של דגימות מטופל רבות זמינות לבדיקה מביאה שפע של מידע החדש ביחס למוטציות גנטיות ומסלולים מעורבים בפתוגנזה GBM והתקדמות והאפשרות של רפואה מותאמת אישית, שבו טיפולים יכולים להיות מותאמים באופן ספציפי ל מומים הגנטיים של המטופל. סופו של דבר, כדי להעריך את הערך המנבא של מוטציות אלה ומסלולים באופן שיטתי, ולבחון טיפולים אפשריים בכל מקרה ומקרה, דורש מודלים של בעלי חיים של GBM עם שינויים גנטיים שנקבע מראש. אינטגרציה בתיווך transposon של הדנ"א הגנומי מציעה גישה אפשרית.
המערכת היפיפייה הנרדמת transposon, חבר Tc1 ספן הכיתה / של transposons, הייתה "מתעורר" (נבנה) בproce רב שלביםss של mutagenesis הספציפי אתר מגן transposase salmonoid, שהפך לפני רדום יותר מ -10 מ'שנים 18,19. בעיקרו של דבר, transposons DNA מוקף רצפים ספציפיים (חוזר הפוך / חזרות ישירות: IR / DR) ניתן לשלב לתוך הגנום באופן "גזור והדבק" באמצעות הפעילות של transposase היפיפה הנרדם. Transposase מכיר את הקצוות של אתרי IR, בולה transposon ומשלב אותו באופן אקראי לאתר DNA אחר בין הבסיסים T ו, בסיסים שישוכפלו בכל קצה של transposon בשכול (איור 1 א). Transposase היפיפה הנרדם מורכב משלושה תחומים, תחום transposon מחייב, רצף לוקליזציה גרעיני ותחום קטליטי. ארבע מולקולות transposase נדרשות להביא את שני קצוות של transposon יחד ולאפשר לשכול, לעומת זאת, אם מולקולות רבות מדי של transposase נמצאות, הם יכולים dimerize וtetramerize לעכבתגובת טרנספוזיציה 20. תגובת טרנספוזיציה יעילה דורשת יחס אופטימלי של transposase לtransposons. DNA קידוד transposase יכול להיות מועבר באותו פלסמיד עם transposon (בcis) או על פלסמיד שונה (בטראנס). כדי להבטיח את היחס האופטימלי בין transposase וtransposons, ניתן לבחור אמרגן עם פעילות מתאימה לביטוי של transposase (למודל "ציס") או היחס של פלסמידים בפתרון ההזרקה יכולה להיות מותאם (ל מודל "טראנס"). מערכת transposon היפיפייה הנרדמת יכולה לשמש בהצלחה לגנומיקה הפונקציונלית, mutagenesis insertional, transgenesis וריפוי גנטי סומטיים 21. להיות מבנה סינטטי מחדש הנדסת מולקולה פונקציונלית מגרסת salmonoid רדומה, transposase היפיפה הנרדם לא להיקשר transposons האחר בבני אדם או יונקים אחרים 20. מאז גילויו, יש הנדסה מולקולרית העשרתed את היעילות של מערכת transposon SB טרנספוזיציה דרך שינויים ברצפי IR ותוספת של dinucleotides TATA איגוף transposon, וכתוצאה מכך transposons pt2. transposons אלה מותאמים מחייב של SB לאתר IR והגדיל את היעילות של כריתה. Transposase SB גם עבר שיפור משמעותי; transposase המשמש בניסויים שהוצגו במסמך זה SB100X, transposase היפראקטיבי שנוצר על ידי אסטרטגית דשדוש DNA ואחריו מסך גנטי בקנה מידה גדולה בתאי יונקים 22.
בדוח זה אנו מציגים שיטה מהירה, תכליתית ושחזור כדי לגרום GBM המהותי בעכברים עם שילוב הלא-נגיפי, בתיווך transposon של פלסמיד דנ"א לתוך תאים של האזור תת-חדרית של עכברי יילודים 23. אנו מציגים דרך פשוטה ליצור transposons עם גני רומן נוח לשילוב הגנומי באמצעות transposase היפיפה הנרדם ומדגים כיצד לפקח על ספיגת פלסמיד והתקדמות מחלה באמצעות פליטת אור. אנחנו גם לאפיין תכונות היסטולוגית והחיסונית histochemical של GBM לשכפל עם המודל הזה. בנוסף, אנו מציגים שיטה מהירה ליצירת שורות תאים ראשוניות GBM מגידולים אלה. המודל היפיפה הנרדם, שבו גידולים הנגרמים מהתאים מקוריים לבעלי החיים, מאפשר הערכה התפקודית של התפקיד של גני GBM מועמד באינדוקציה וההתפתחות של גידולים. מערכת זו גם מתאימה גם לבדיקות של טיפולי GBM רומן, כוללים טיפולים חיסוניים בעכברים חיסוניים מוסמכת, ללא הצורך בניתוחים פולשניים דלקתיים, אשר עשוי לשנות את המיקרו-הסביבה המקומית.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו פירוט שיטה תכליתית ושחזור ליצירת מודלים חדשים של GBM באמצעות שילוב transposase- SB בתיווך של פלסמיד דנ"א שעור לתאים המקיפים את אזור subventricular של עכברים בילוד. אנו מציגים פרוטוקול להפקת פלסמידים transposon עם גנים חדשים של עניין, להמחיש כיצד לפקח על ההתקדמות של הגידו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
Riferimenti
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- . Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Ricerca sul cancro. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
