Omfattande Bedömning av nedärvda Kemisk toxicitet Använda Nematode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Identifiera reproduktionstoxicitet av de tusentals kemikalier som finns i vår miljö har varit en av de mest kittlande utmaningarna inom miljö och hälsa. Detta beror delvis på bristen på modellsystem som kan (1) exakt rekapitulera nycklar funktioner i reproduktiva processer och (2) gör det på ett medel- till hög genomströmning fashion, utan behov av ett stort antal ryggradsdjur.
Vi beskriver här en analys i nematoden C. elegans som gör snabb identifiering av nedärvda gifter genom att övervaka induktion av aneuploida embryon. Genom att använda sig av en GFP reporter linje, är fel i kromosomsegregation följd av könsceller störningar lätt visualiseras och kvantifieras genom automatiserad fluorescensmikroskopi. Således kan utföras screening av en viss uppsättning föreningar för sin giftighet i ett 96- till 384-brunnar format på några dagar. Sekundär analys av positiva hdess kan utföras för att fastställa om de kromosomavvikelser härstammar från meiotisk avbrott eller från tidiga embryonala kromosomsegregation fel. Sammantaget innebär denna analys en snabb första passage strategi för snabb bedömning av könsceller dysfunktion efter kemisk exponering.
Introduction
Det finns cirka 87.000 kemikalier registrerade för handel i USA, men bara ett fåtal av dessa har testats för potentiella hälsoeffekter en. Av dem som har testats, har endast en del bedömts för reproduktiva hälsoeffekter beror delvis på svårigheten att fastställa ändring av de tidiga reproduktiva händelser i däggdjur, särskilt under kvinnliga könsceller utveckling och differentiering. Faktum de första meiotiska evenemang äger rum under de tidiga stadierna av embryonal utveckling hos kvinnliga däggdjur och är därför svåra att komma åt och samla in siffror som är lämpliga för screening.
Den nedärvda ger den avgörande länken mellan generationerna, och dess lämplig funktion är beroende av den exakta utförandet av intrikata program för cell- och kromosomala division kallas meios. Dysreglering av meiotiska processen kan resultera i minskad fertilitet och produktionen avkönsceller och embryon med ett onormalt antal kromosomer, ett tillstånd som kallas aneuploidi. Kromosomsegregation fel i meios är mycket relevanta för människors hälsa. Kromosomavvikelser är vanliga, med en frekvens på 1 i 150 levande födda, trisomi 21, 18 och 13 samt X och Y-kromosom fel vara de vanligaste typerna 2,3. Dessutom medfödda missbildningar, inklusive de av kromosomala ursprung, är den ledande orsaken till spädbarnsdöd i USA 4 Tanken att miljöpåverkan kan påverka kromosomsegregation och beteende är inte ny 5, men är fortfarande dåligt kända. Det är därför mycket viktigt att undersöka vilka av de kemikalier som införts i vår miljö stör human fertilitet, tidig utveckling och övergripande reproduktiv hälsa.
Mot bakgrund av dessa begränsningar av däggdjursmodeller, har vi utvecklat en hög genomströmning skärm analys för att testa reproduktionstoxicitet i rundmasken <em> C. elegans. Vi har mobiliserat flera viktiga funktioner som erbjuds av denna vanligt förekommande genetiska modellsystem såsom dess ringa storlek, låg kostnad, kort reproduktionscykel, hög andel av könsceller och enkel manipulation 6. Maskar kan odlas i 96-brunnsplattor eller i höga volymer flytande kulturer och på grund av deras transparens kan direkt avbildas på plattor för detektering av fluorescerande reportrar. Den analys som beskrivs nedan utnyttjar dessa egenskaper och utnyttjar en mask stam innehållande den fluorescerande reporter Pxol-1 :: GFP att upptäcka nedärvda störningar och induktion av embryonala aneuploidi.
Användningen av denna reporter stam är baserad på allmänt sällsynta förekomsten av hanar i ett huvudsakligen hermafroditisk mask befolkningen. Dessa män (<0,2%) naturligt härrör från fel i segregeringen av X-kromosomen 7. Men som könsceller störningar ofta leder till fel i segregering av autosomeroch heterochromosomes, korrelerar det både med en förhöjd incidens av manlig fenotyp (X missegregation) samt embryonal dödlighet (Autosom missegregation). För att enkelt detektera induktion av hanar medan kringgår frågan om embryonal dödlighet, är en manlig specifik promotor (XOL-1) som används för att driva uttryck av GFP i tidiga embryon fortfarande finns inom masken livmoder. Som sådan är uppkomsten av GFP-uttryck embryon används som en proxy för förekomst av aneuploida embryon. Denna metod har tidigare använts för att identifiera gener som är inblandade i arvslinjeunderhåll och meios 8,9. Anpassad till kemisk screening, är denna stam användes i ett medium till hög kapacitet skärm. Viktigt stammen rapporterar troget aneugenicity av kemikalier och är därför relevant för däggdjurs reproduktiva endpoints 10. Den analys som beskrivs här kommer att vara särskilt användbart för toxikologer i läkemedels- och kemisk industri inställningar sökeratt snabbt bedöma hur giftiga kemikalier mot reproduktiva endpoints. Dessutom denna analys helt i linje med de statliga prioriteringar markerade i toxicitet i det 21: a århundradet rapport 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs här utgör den första storskaliga strategi för identifiering av nedärvda gifter. Det kräver användning av en GFP transgen Pxol-1 :: GFP innehåller stam som troget rapporterar induktion av aneuploidi i tidiga embryon som används som en proxy för könsceller dysfunktion. Metoden involverar noggrann synkronisering av ett C. elegans mask befolkning och maskar "exponering för kemikalier i 96-brunnsformat följt av avbildning av GFP positiva maskar genom automatiserad h?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
Riferimenti
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetica. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
