Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Identificare la tossicità riproduttiva delle migliaia di sostanze chimiche presenti nel nostro ambiente è stata una delle sfide più allettanti nel campo della salute ambientale. Ciò è dovuto in parte alla scarsità di sistemi modello che può (1) ricapitolare accuratamente chiavi caratteristiche dei processi riproduttivi e (2) lo fanno in un medio di moda high-throughput, senza la necessità di un elevato numero di animali vertebrati.
Descriviamo qui un test nel nematode C. elegans che permette la rapida identificazione delle sostanze tossiche linea germinale monitorando l'induzione di embrioni aneuploidi. Facendo uso di una linea di GFP giornalista, errori nella segregazione dei cromosomi derivanti da interruzioni germinale sono facilmente visualizzati e quantificati al microscopio a fluorescenza automatizzata. Così la proiezione di un particolare insieme di composti per la sua tossicità può essere eseguita in un formato di piastra da 96 a 384 pozzetti in pochi giorni. Analisi secondaria di h positivola sua può essere eseguita per stabilire se le anomalie cromosomiche originati da interruzioni meiotic o dai primi errori segregazione dei cromosomi embrionali. Complessivamente, questo test rappresenta una veloce strategia di primo passaggio per la rapida valutazione della disfunzione linea germinale dopo l'esposizione chimica.
Introduction
Ci sono circa 87.000 sostanze chimiche registrate per il commercio negli Stati Uniti, ma solo un piccolo numero di questi sono stati testati per i potenziali effetti sulla salute 1. Di quelli che sono stati testati, solo una parte è stata esaminata per effetti sulla salute riproduttiva dovuti in parte alla difficoltà di determinare alterazioni degli eventi riproduttivi primi nei mammiferi, in particolare durante lo sviluppo delle cellule germinali femminile e differenziazione. In effetti, i primi eventi meiotici hanno luogo durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei mammiferi di sesso femminile e sono quindi di difficile accesso e raccogliere in numero adeguato a fini di screening.
La linea germinale fornisce il collegamento cruciale tra le generazioni, e la sua funzione appropriata dipende dalla precisa esecuzione del programma intricata di divisione cellulare e cromosomico chiamato meiosi. Disregolazione del processo meiotica può causare ridotta fertilità e la produzione digameti ed embrioni con un numero anormale di cromosomi, una condizione nota come aneuploidie. Errori segregazione cromosomiche in meiosi sono molto importanti per la salute umana. Anomalie cromosomiche sono comuni, con una frequenza di 1 a 150 nati vivi, Trisomia 21, 18 e 13, nonché X e Y errori cromosomiche che sono i tipi più diffusi 2,3. Inoltre, malformazioni congenite, incluse quelle di origini cromosomiche, sono la principale causa di morte infantile negli Stati Uniti 4 L'idea che le influenze ambientali possono influenzare la segregazione e il comportamento cromosomico non è nuovo 5, ma è ancora poco conosciuta. E 'quindi fondamentale indagare quali delle sostanze chimiche introdotte nel nostro ambiente stanno interferendo con la fertilità umana, lo sviluppo della prima e della salute riproduttiva generale.
Alla luce di queste limitazioni dei modelli mammiferi, abbiamo sviluppato un saggio schermo high-throughput per testare la tossicità riproduttiva nel verme <em> C. elegans. Abbiamo mobilitato diverse importanti caratteristiche offerte da questo sistema modello genetico di uso comune come le sue piccole dimensioni, a basso costo, ciclo di riproduzione breve, alta percentuale di cellule germinali e la facilità di manipolazione 6. Worms possono essere coltivate in piastre da 96 pozzetti o in volume di culture alte e liquidi a causa della loro trasparenza possono essere esposte direttamente su piastre per la rilevazione di giornalisti fluorescenti. Il test descritto di seguito sfrutta queste caratteristiche e si avvale di un ceppo verme contenente il reporter fluorescente Pxol-1 :: GFP per rilevare interruzioni germinale e induzione di aneuploidie embrionale.
L'uso di questo ceppo giornalista si basa sul generalmente scarsa incidenza maschi in una popolazione verme principalmente ermafrodita. Questi maschi (<0,2%) naturalmente provengono da errore nella segregazione del cromosoma X 7. Tuttavia, come interruzione linea germinale porta spesso ad errori in segregazione di autosomie di eterocromosomi, si correla sia con una elevata incidenza di maschi fenotipo (X missegregation) e letalità embrionale (autosoma missegregation). Per rilevare facilmente l'induzione dei maschi, mentre eludere la questione della letalità embrionale, un promotore maschio-specifica (Xol-1) è usato per guidare l'espressione di GFP in embrioni precoci ancora contenuti all'interno dell'utero del worm. Come tale, la comparsa di embrioni-GFP esprimere viene utilizzato come proxy per la presenza di embrioni aneuploidi. Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per identificare i geni implicati nella linea germinale manutenzione e meiosi 8,9. Adattato per lo screening chimico, questo ceppo è impiegato in un mezzo di schermo ad alta produttività. È importante sottolineare che il ceppo riporta fedelmente la aneugenicity di sostanze chimiche ed è quindi rilevante per endpoint riproduttivi dei mammiferi 10. Il test qui descritto sarà particolarmente utile per i tossicologi in ambienti dell'industria chimica farmaceutica e ricercadi valutare rapidamente la tossicità delle sostanze chimiche verso endpoint riproduttivi. Inoltre, questo test allinea pienamente con le priorità governative evidenziati nella tossicità nel 21 ° rapporto secolo 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto costituisce la prima strategia larga scala per l'identificazione di sostanze tossiche germinali. Si richiede l'uso di un transgenico GFP Pxol-1 :: GFP contenente ceppo che riporta fedelmente l'induzione di aneuploidie in embrioni precoci che viene utilizzato come proxy per la disfunzione linea germinale. Il metodo prevede l'accurata sincronizzazione di un C. popolazione verme elegans e l'esposizione a sostanze chimiche worm 'in formato a 96 pozze…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
Riferimenti
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