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Biologia

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Published: April 14, 2015
doi:
10.3791/52452
, , , , , , ,
1Department of Biology,San Diego State University

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

이러한 형광 분광법, 형광 현미경 및 유동 세포 계측법 같은 기술은, 모두 형광에 의존 속성은 널리, 생화학 생물 의학, 화학 응용 프로그램에서 악용. 형광 극한 또는 라벨링을 통해 단백질 발현 패턴과 프로필, 세포의 운명, 단백질 결합 및 생물학적 기능 1-9의 분석을 위해 이용하고,되었는지 생체 분자 상호 작용 및 구조 변화의 검출을위한 형광 / 포스터 공명 에너지 전이를 통한 10-13. 빅토리아 (Aequorea victoria) 녹색 형광 단백질 (GFP) (14)의 분리 이후, 다른 자포 동물, 특히 산호로부터 추가 천연 형광 단백질의 발견은, 크게 구별 여기 / 발광 스펙트럼을 가진 기존의 형광 단백질의 수가 증가하고있다. 이 함께 유전자 15-19의 돌연변이의 도입으로, 근래전자는 또한 자신의 연구를위한 세포 계측법 및 기타 형광 기반 기술 흐름, 현미경을 이용 과학자 사용할 수 형광 단백질의 진정한 표를 획득, 가능성을 확장했다.

이와 병행하여, 독립적이지만, 레트로 바이러스 기술의 개발이 크게 포유 동물 세포에서 20-23 이소성 유전 정보의 발현 안정성을 촉진했다. 그것은이 기술은 세포 및 조직 유형의 24-28 넓은 수로 29-31 또는 형질 전환 동물의 생산을위한 형광 단백질 유전자를 전송하기 위해 사용되었는지 따라서 놀라운 일이 아니다. 레트로 바이러스의 성질에 따라, 자궁외 형광 단백질의 유전 정보는 셀 (32)의 게놈 내에 도입되고, 셀에 대한 '형광 ever'된다. 이 속성은 세포 운명의 추적을 허용, 또는 세포 집단 내에서 단일 셀의했다. 지금 형광 세포 따라서 아퀴있다자신의 biosignature 빨간색과 바코드로 정의 할 수 있습니다. 독특한 biosignature 다른 세포를 식별하고, 중요한 것은 유 전적으로 구별 흡수 / 방출 스펙트럼과 다른 형광 단백질을 표현하기 위해 조작 된 세포를 구분합니다. 이러한 다 능성 33 향해 리 프로그래밍 인자 트래킹 생물학적 응용 핵소체 지역화 34 해명 용 subnuclear 요인 분석, 전사 연구 35 또는 신경 네트워크 구조 (36)의 연구 뉴런의 유전 표지 용 형광 리포터 플라스미드의 구성 같은 실험 장치에 대해 서로 다른 형광 단백질 유전자를 악용 한 그 많은 단지 네 가지 예입니다.

계측법 대체로 이러한 유전자 발현, 세포주기, 아폽토시스 같은 단일 세포 수준에서의 생물학적 과정의 분석을 위해 이용하고, 포스 포릴 통해 시그널링 된 흐름포유 동물 세포에 형광 단백질 유전자의 ATION 37-43 국지적 인 안정 표현은 더 셀 분석 38,44과 리간드 – 수용체 상호 작용 45 유동 세포 계측법의 유틸리티를 강화했다. 강화 된 기능은 세포 계측법 높은 처리량과 높은 콘텐츠가 46 스크리닝 널리 활용 방법이 될 흐름을 허용했다. 몇 플레이트 리더 시스템, 영상 및 유동 세포 계측법 수 fluorometers과 로봇 기술의 현재 확장 수에도 불구하고, 악용이 향상된 기술력을 들어갈 수있는 실험 설계의 부족있을 것 같습니다.

빠르고 안정적​​ 간단하고 강력한 세포 기반 방법들이 대폭 더 높은 처리 능력을 향상 다중화 애플리케이션 필요하다. 다중화 형식의 엔지니어링 세포 기반 분석은 높은 처리량 검사 39,47-50의 능력을 향상시킬 수있는 곳은 신약 개발 분야에서 특히 그러하다 </sup>. 그것은 하나의 샘플에서 동시 분석을 허용하는 멀티플렉싱, 더 높은 처리 능력 (51 ~ 54)을 향상시킨다. 형광 바코드 유전 우아한 다중화를 허용 할뿐만 아니라, 일단 설계 시간을 소비하는 다른 프로토콜의 필요성을 회피, 항체, 구슬 얼룩 39,52,55 수반 비용을 감소시키고, 고 필요한 화면 수를 감소시킬뿐만 아니라 처리 응용 프로그램. 우리는 최근 생물학적 응용 프로그램에 대한, 이전에 다른 임상 적으로 널리 변종 (58) HIV-1 단백질 분해 효소 활동 56,57을 모니터하기 위해 개발 된 분석을 표현함으로써 형광 유전자 바코드를 통해 멀티플렉싱을 어떻게 향상시킬 수 있는지 레트로 바이러스 기술을 설명했다. 방법론은 선택한 유전자 형광 바코드 세포를 증폭하고 뚜렷한 형광 단백질 및 / 또는 상이한 형광 intensit 발현 클론 개체군의 패널을 제조하는 방법을하는 방법에 초점을보다 설명하게 설명한다이거 야. 자신의 형광 특성에 따라 구별 세포 집단의 패널은 또한 다른 생물학적 문제를 해결 세포 기반 분석과 함께 이용 될 수있다 다중화 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 예를 들어 59로, 이전에 실험실에서 개발 된 세포 기반 분석의 한 베어링 바코드 세포의 패널을 설계하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 유전자 전달을위한 잘 확립 된 레트로 바이러스 / 렌티 기술, 형광 단백질의 값 또는 60,48 유세포의 어플리케이션을 나타 내기위한 것은 아니고, 오히려 다중 애플리케이션을 위해 세 개의 조합의 강화 능력을 보여주는.

Protocol

포유 동물 세포, 유전자 바코드에 대한 바이러스 생산 및 형질 도입 1. 준비 10cm 접시에 플레이트 2.5 × 10 6 부착 세포 (또는 주위 50-60%의 컨 플루) 둘 베코의 수정 독수리 중간 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FCS)에 Transfection 하루 전날. 이러한 피닉스 GP (게리 놀란, 스탠포드 대학에서 일종의 선물)와 같은 선택의 레트로 바이러스 생산 사용 포장 세포 라인. 주 : 패키징 세포주는 안정적…

Representative Results

다중화 형광 유전자 개별 클론 집단이 생성되면 만 달성 될 수 생물학적 응용을 목적으로 세포를 바코드. 바코드 인구가 최소한의 스펙트럼 오버랩 명확 별개의 형광 특성이있을 때 다중 가장 효과적입니다. 포유류 SupT1 세포의 클론 집단으로도 1에 도시 된 예와 mCherry 아노 형광 단백질 (CFP)와 바코드 세포 용이 개별 형광 특성을 잃지 않고 동시에 분석 할 수 있음을 나타낸다. 이 행렬…

Discussion

여기에 두 잘 확립 된 절차가 결합되었습니다; 레트로 바이러스 및 기술을 이용하여 유세포 형광 단백질의 검출을 통해 유전 공학. 고유 세포주의 제조 계 형광 단백질 유전자 바코드 다중화 애플리케이션 견고하고 간단한 방법을 제공한다. 레트로 바이러스 유전자 조작 기술을 통해 세포 바코드를 생성하는 초기 긴 과정이지만, 한 번, 셀 물질의 신뢰성 있고 안정된 소스를 설립 얻게한다. 이 기?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 레트로 바이러스 입자의 생산을 위해 피닉스 GP 포장 세포주를 제공하기 위해 스탠포드 대학에서 박사 게리 놀란에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 TD 토마토를 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학에서 박사 로저 첸 감사합니다. 우리는 또한 자신의 서비스와 도움을 샌디에고 주립 대학 유동 세포 계측법 핵심 시설에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10mL syringes BD   309604 used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter pall corporation 4219 used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Corning 45000-304 cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine) poly sciences 23966-2  2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) Eppendorf  5805 000.017 used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline) Corning 21-040-CV used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide) Sigma-Aldrich 107689 Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration. 
FACSAria BD Biosciences instrument used for sorting cell populations
FACSCanto BD Biosciences instrument used for cell analysis
Phoenix-GP Gift from Gary Nolan cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum Mediatech MT35015CV  used for cell growth and sorting
 SupT1 cells ATCC CRL-1942 Human T lymphoblasts
HEK 293T cells ATCC CRL-11268 Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640 Corning 10-040-CV cell growth media for SupT1 cells
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Riferimenti

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Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).
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