Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

טכנולוגיות כגון ספקטרוסקופיה הקרינה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה, כל להסתמך על הקרינה, רכוש ניצל נרחב ביישומים ביוכימיים, ביו-רפואיים, וכימיים. הקרינה, בין אם פנימי או באמצעות תיוג, נוצל לניתוח דפוסי חלבון ביטוי ופרופילים, גורל תא, אינטראקציות חלבון ותפקודים ביולוגיים ^1-9, ובאמצעות הקרינה / העברת אנרגיית תהודת פורסטר לצורך זיהוי של אינטראקציות biomolecule ושינויי קונפורמציה ^10-13. מאז את בידודו של חלבון Aequorea ויקטוריה הירוק הניאון (GFP) ^14, הגילוי של חלבוני ניאון טבעיים נוספים מצורבים אחרים, במיוחד אלמוגים, במידה רבה הגדיל את מספר חלבוני ניאון הקיים עם ספקטרום עירור / פליטה להבחין. אלה, יחד עם ההקדמה של מוטציות בגנים שלהם ^15-19, havהדואר הרחיב עוד יותר את האפשרויות, קבלת צבעים נכונים של חלבוני ניאון זמינים למדענים המנצלים מיקרוסקופיה, cytometry זרימה וטכנולוגיות מבוססי הקרינה אחרות למחקר שלהם.

במקביל, אם כי באופן עצמאי, הפיתוח של טכנולוגית retroviral אופן דרסטי הקל הביטוי היציב של מידע גנטי מחוץ לרחם בתאי יונקים ^20-23. לכן אין זה מפתיע כי טכנולוגיה זו נעשתה שימוש כדי להעביר את הגנים של חלבוני ניאון למספר רחב של סוגי תאים ורקמות ^24-28 או לייצור בעלי החיים מהונדסים ^29-31. בעקבות הטבע של רטרווירוסים, המידע הגנטי של החלבון פלואורסצנטי מחוץ לרחם הוא הציג בתוך הגנום של התא ³² והתא הופך ניאון 'לever'. מאפיין זה מאפשר מעקב אחר גורל תא, או של תא בודד בתוך אוכלוסייה של תאים. התא עכשיו הניאון יש בכך אקיאדום biosignature משלו ויכול להיות מוגדר כהמבורקד. biosignature הייחודי שלה מזהה אותו מהתאים אחרים, וחשוב מכך, מבדיל אותו מהתאים גנטי מניפולציות להביע חלבוני ניאון שונים עם ספקטרום קליטה / פליטה להבחין. יישומים ביולוגיים כגון המעקב של גורמי תכנות מחדש לקראת pluripotency ^33, הניתוח של גורמי subnuclear להבהרת לוקליזציה nucleolar ^34, הבנייה של פלסמידים כתב ניאון ללימודי תעתיק ³⁵ או התיוג הגנטי של תאי עצב לחקר ארכיטקטורת רשת עצבית ³⁶ , הן רק ארבעה דוגמאות של רב שנצלו גני חלבון פלואורסצנטי שונים עבור אותו התקנה ניסיונית.

Cytometry זרימה כבר בשימוש נרחב לניתוח של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד, כגון ביטוי גנים, מחזור תא, אפופטוזיס, ואיתות באמצעות phosphorylation ^37-43 .the ביטוי יציב של גני חלבון פלואורסצנטי בתאי יונקים שיפר עוד יותר את השירות של הזרימה cytometry לאינטראקציות תא ניתוח ^38,44 ויגנד לקלוט ^45. יכולות משופרות אפשרו זרימת cytometry להפוך למתודולוגיה שימוש נרחב לתפוקה גבוהה וגבוה תוכן הקרנת ^46. למרות המספר כעת המורחב של fluorometers ורובוטיקה טכנולוגיות שיכולים מערכות צלחת זוג קורא, הדמיה וcytometry זרימה, נראה שיש חוסר בתכנון ניסוי שיכול לנצל ולהתאים את יכולות טכנולוגיות משופרות אלה.

מתודולוגיות מבוססות תאים מהיר, אמינות, פשוטות וחזקה יש צורך באופן דרסטי עבור יישומים מרובבים שיחזקו את יכולת תפוקה גבוהה. הדבר נכון במיוחד בתחום של גילוי תרופות שבו מבחני מבוססי תאי הנדסה בפורמט ריבוב יכולים לשפר את הכח של הקרנת תפוקה גבוהה ^39,47-50 </sup>. ריבוב, שכן היא מאפשרת ניתוחים בו זמנית במדגם אחד, משפר עוד יותר את יכולות תפוקה גבוהה ^51-54. barcoding הגנטי ניאון לא רק מאפשר לריבוב אלגנטי, אלא גם, מהונדס פעם, עוקף את הצורך של פרוטוקולי זמן רב, מפחית את עלויות מלווים בנוגדנים, חרוזים וכתמים ^39,52,55, ויכול להפחית את מספר המסכים הנדרש לגבוה יישומי תפוקה. יש לנו תארנו לאחרונה איך retroviral טכנולוגיה יכול לשפר את הריבוב דרך barcoding הגנטי ניאון עבור יישומים ביולוגיים, בהבעת assay שפותח בעבר כדי לעקוב אחר פעילות פרוטאז HIV-1 ^56,57 עם גרסאות קליניות נפוצות שונות ^58. המתודולוגיה מוסברת באופן תיאורי יותר התמקדות על איך לבחור ולהגביר תאי המינימרקטים גנטי ניאון ואיך לייצר פנלים של אוכלוסיות משובטים להביע חלבוני ניאון שונים ו / או intensit הקרינה שונהies. פנלים של אוכלוסיות תאים להבחין בהתבסס על מאפייני הניאון שלהם לשפר את יכולות מרובבות, אשר ניתן לניצול נוסף בשילוב עם מבחני מבוססי תאים שהתמודדות עם שאלות ביולוגיות שונות. הפרוטוקול מתאר גם כיצד להנדס פנל של תאי המינימרקטים נושא אחד מבחני מבוססי תאים שפותחו בעבר במעבדה, כמו בדוגמה של ^59. פרוטוקול זה ולכן לא נועד להראות את הטכנולוגיה מבוססת היטב retroviral / lentiviral להעברה גנטית, את הערך של חלבוני ניאון או היישומים של זרימת cytometry ^60,48 אלא כדי להראות את כוח שיפור של שילוב שלושה עבור יישומים מרובבים.

Protocol

1. הכנת תאי יונקים, ייצור נגיפים ותמרה לBarcoding הגנטי צלחת 2.5 x 10 6 תאים חסיד בצלחת 10 סנטימטר (או confluency סביב 50-60%) יום אחד לפני transfection במדיום הנשר (DMEM) עם 10% עוברי עגל בסרום (FCS) שונה Dulbecco. לתא-קו אריזת שימוש ייצור retroviral של ב…

Representative Results

ניאון Multiplexing גנטי המינימרקטים תאים לצורך היישומים ביולוגיים יושג רק פעם אחת אוכלוסיות משובטים בודדות כבר נוצרו. הריבוב הוא יעיל ביותר כאשר יש לי אוכלוסיות המינימרקטים מאפייני ניאון מובהקים ברורים עם חפיפה ספקטרלית מינימאלית. הדוגמא שמוצגת באיור 1 עם אוכלו…

Discussion

הנה שני הליכים מבוססים היטב כבר בשילוב; הנדסה גנטית באמצעות טכנולוגיה וזיהוי של חלבוני ניאון ניצול זרימת cytometry retroviral. barcoding הגנטי ניאון המבוסס על חלבונים לייצור של שורות תאים ייחודיות מספק דרך חזקה ופשוטה ליישומים מרובבים. יצירת תאי המינימרקטים מהונדסים גנטי באמצעו?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10mL syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter	pall corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells