Генетический штрих кода с флуоресцентных белков для мультиплексированных приложений

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Такие технологии, как флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, все полагаются на флуоресценции, недвижимость широко используется в биохимических, медико-биологических и химических применений. Флуоресценции, будь внутренняя или с помощью маркировки, эксплуатируется для анализа белковых паттернов экспрессии и профилей, клеточной судьбы, белковых взаимодействий и биологических функций ^1-9, а через флуоресценции / Ферстер резонансный перенос энергии для обнаружения биомолекул взаимодействий и конформационных изменений ^10-13. Так изоляции Aequorea Виктория зеленого флуоресцентного белка (GFP) ^14, открытие дополнительных природных флуоресцентных белков из других кишечнополостных, в частности, кораллы, в значительной степени увеличилось число существующих флуоресцентных белков с различимым спектров возбуждения / эмиссии. Эти, а также с введением мутаций в генах ^15-19, ВГАе расширена возможности, получение истинного палитру флуоресцентных белков в распоряжение ученых, которые используют микроскопии, проточной цитометрии и другие флуоресценции на основе технологии для их исследования.

Параллельно, хотя независимо, развитие ретровирусной технологии резко способствовали стабильной экспрессии эктопического генетической информации в клетках млекопитающих ^20-23. Таким образом, не удивительно, что эта технология используется для передачи гены флуоресцирующих белков в широком ряде типов клеток и тканей ^24-28 или для производства трансгенных животных ^29-31. После природе ретровирусов, генетическую информацию о внематочной флуоресцентного белка вводят в геном клетки ³² и клетка становится люминесцентные `для ever'. Это свойство позволило отслеживать судьбу клеток, или из одной клетки в популяции клеток. Теперь люминесцентные ячейка имеет, таким образом, Акуикрасный свою biosignature и может быть определена как Barcoded. Его уникальная biosignature идентифицирует его от других клеток, и, что важно, отличает его от клеток генетически измененных выразить различные белки люминесцентные различимы спектров поглощения / излучения. Биологические приложения, такие как отслеживание факторов перепрограммирования к плюрипотентности ^33, анализ субъядерных факторов для выяснения ядрышек локализации ^34, строительство люминесцентных репортер плазмид для транскрипции исследований ³⁵ или генетического маркирования нейронов для изучения нейронной сети архитектуры ³⁶ , всего четыре примеры многих, которые эксплуатируются различные гены флуоресцентного белка для той же экспериментальной установке.

Проточной цитометрии был широко используются для анализа биологических процессов на уровне одной клетки, такие как экспрессии генов, клеточного цикла, апоптоза и передачи сигналов через фосфорильнойция ^37-43 .The стабильная экспрессия люминесцентных генов белков в клетках млекопитающих еще больше повышает полезность проточной цитометрии для анализа клеток ^38,44 и лиганд-рецепторных взаимодействий ^45. Расширенные возможности позволили проточной цитометрии, чтобы стать широко используются методология высокой пропускной и высокого содержания скрининга ^46. Несмотря на в настоящее время расширенного ряда флуорометры и робототехника технологий, которые могут систем читатель пара плита, изображения и проточной цитометрии, там, кажется, отсутствие в опытно-конструкторских, которые могут использовать и подходят эти расширенные технологические возможности.

Быстрый, надежный, простой и надежной методологии на основе клеток являются резко необходимы для мультиплексированных приложений, которые дальнейшего повышения высокой пропускной способности. Это особенно верно в области открытия лекарств, где анализы инженерные основе клеток в мультиплексной формате может повысить мощность высокопроизводительного скрининга ^39,47-50 </sup>. Multiplexing, так как она позволяет одновременно анализ в одном образце, еще больше повышает возможности с высокой пропускной способностью ^51-54. Флуоресцентный генетического штриховое кодирование позволяет не только элегантной мультиплексирования, но после того, как инженерии, избежать необходимости протоколов времени, снижает затраты в сопровождении с антителами, шариков и пятен ^39,52,55, и может уменьшить количество экранов, необходимые для высокого высокой пропускной способности. Недавно мы описали, как ретровирусный технологии могут повысить мультиплексирование через флуоресцентного генетического штрих-кодирования для биологических применений, путем экспрессии продукта по результатам анализа ранее разработанный, чтобы контролировать ВИЧ-1 протеазы с различными ^56,57 клинически распространенных вариантах ^58. Методология поясняется в более описательный характер внимание на том, как выбрать и усилить генетически флуоресцентные штрих-кодом клетки и как производить панели клоновых популяциях, выражающие различные флуоресцентные белки и / или другой флуоресценции intensitх гг. Панели клеточных популяций различимых на основе их флуоресцентных характеристик повышения мультиплексированных возможности, которые могут быть дополнительно эксплуатируемых в комбинации с анализов на основе клеток, направленных на решение различных биологических вопросы. Протокол также описывает, как спроектировать панель со штрих клеток, несущих один из анализов на основе клеток ранее разработанных в лаборатории, в качестве примера ^59. Этот протокол, таким образом, не предназначены, чтобы показать устоявшуюся ретровирусную / Lentiviral технологии для передачи генетического, значение флуоресцентных белков или приложения проточной цитометрии ^60,48, а чтобы показать повышая мощность объединения трех для мультиплексированных применений.

Protocol

1. Подготовка клетках млекопитающих, вирусный производства и трансдукции генной штриховое кодирование Пластинчатые 2,5 × 10 6 адгезивные клетки в 10 см пластины (или около 50-60% слияния) за один день до трансфекции в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фета?…

Representative Results

Мультиплексирование флуоресцентный генетически Barcoded клеток с целью биологических применений может быть достигнуто только когда отдельные клоновых популяции были получены. Multiplexing является наиболее эффективным, когда штрих-кодом группы населения имеют четкие различных флуоресцентн…

Discussion

Вот два хорошо установленных процедур были объединены; генная инженерия через ретровирусов технологии и обнаружения флуоресцентных белков с использованием проточной цитометрии. Флуоресцентного белка на основе генетического штрих кода для производства уникальных клеточных линий о?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10mL syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter	pall corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells