Un essai biologique de petit volume pour évaluer bactérienne / phytoplancton co-culture avec de l'eau-Pulse-modulé en amplitude (EAU-PAM) Fluorimétrie
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Les procédés classiques pour la manipulation expérimentale de microalgues ont utilisé de grands volumes de culture (20 ml) à 5 L, de sorte que la culture peut être sous-échantillonné pendant toute l'expérience 1-7. Le sous-échantillonnage de grandes quantités peut être problématique pour plusieurs raisons: 1) il provoque la variation du volume total et l'aire de surface: rapport en volume de la culture au cours de l'expérience; 2) pseudo-réplication (c.-à répliquer des échantillons de la même flacon de traitement 8) est souvent employé plutôt que de véritables répétitions (ce est à dire, l'échantillonnage des traitements répétés); 3) la durée de l'expérience est limitée par le volume total; et 4) les cultures axéniques ou le microbiote bactérienne d'habitude sont difficiles à maintenir au cours des expériences à long terme que la contamination se produit souvent au cours de sous-échantillonnage.
L'utilisation de plaques de microtitration permet volumes de culture 1 ml d'être utilisés pour chaque répétition, avec un maximum de 48 traitements distincts dansune plaque 12,65 cm x 8,5 x 2,2, diminuant ainsi le volume expérimental et permettant la replication extensive sans aucun traitement de sous-échantillonnage. En outre, cette technique peut être modifiée pour se adapter à une variété de formats, y compris expérimentales: bactérienne-algues co-cultures, tests d'algues de la physiologie et la toxine de dépistage 9-11. Puits individuels avec une algue, une bactérie et / ou co-cultures peuvent être prélevés pour de nombreuses procédures de laboratoire, y compris, mais sans s'y limiter: EAU-Pulse-modulé en amplitude (EAU-PAM) fluorométrie, la microscopie, formation de colonies bactériennes unité (ufc) comtes et cytométrie de flux. La combinaison du format de plaque de microtitration et EAU-PAM fluorométrie permet de multiples mesures rapides de rendement photochimique et d'autres paramètres photochimiques avec une faible variabilité entre les échantillons, une reproductibilité élevée et évite les nombreux pièges de sous-échantillonnage une bonbonne ou fiole conique au cours d'une expérience .
Introduction
Phytoplancton physiologie a traditionnellement été étudiée dans des expériences à méso-échelle allant de 20 ml dans des flacons coniques à 5 L dans des bonbonnes 1-7. Cette échelle expérimentale exige le sous-échantillonnage pour la surveillance expérimentale, comme sacrifier échantillons répétés pour chaque point de temps crée un dispositif expérimental ingérable.
La capacité d'augmenter le nombre d'expériences indépendantes tout en utilisant le même espace d'incubateur diurne par miniaturiser le volume expérimental pour des expériences de physiologie algues réduiront ou élimineront les limites de sous-échantillonnage et de pseudo-réplication à partir de grands volumes. Un format de plaque de microtitrage a été développé pour des essais biologiques d'algues en utilisant un volume de culture de 1 ml pour manipuler expérimentalement algues dans des conditions variables. Ce faible volume expérimental permet pour le nombre de répétitions d'augmenter, augmente la reproductibilité expérimental en raison d'une diminution de la variabilité entre les échantillons répétés etexpériences, et permet une véritable réplication tout en maintenant les contrôles expérimentaux (ie, les cultures d'algues axéniques) pour 140 jours (Figure 2) 12.
Ce format de plaque de microtitrage peut être facilement adapté pour une variété de questions expérimentales, telles que: une bactérie ne ont une interaction symbiotique, neutre ou pathogène avec son hôte algues? Est l'addition d'un composé stimulant ou toxiques pour une algue? Ces questions et d'autres peuvent être traitées de manière à haut débit rapide en utilisant ce nouveau format 9-11.
Une plaque de culture de microtitrage 48 puits permet à chaque 1 ml ainsi d'être un montage expérimental indépendant qui est échantillonné à un seul point dans le temps. Différents paramètres peuvent être échantillonnés à partir de ce volume de 1 ml, y compris, mais sans s'y limiter: fluorescence de la chlorophylle et les paramètres photochimiques utilisant-modulé en amplitude EAU-Pulse (EAU-PAM) fluorométrie (voir tableau Matériaux et équipement) 13. EAU-PAM fluorométrie est une technique rapide et non invasive qui peut être utilisé pour surveiller les expériences réalisées avec des algues 13. Il permet de mesurer l'efficacité photosynthétique et PSII santé à partir d'un petit volume de culture (150 à 300 ul de la culture dans un milieu dilué à une 2 – volume de 4 ml d'eau de water-PAM) 14,15. En plus de l'eau-PAM fluorométrie, cette configuration peut être utilisée pour mesurer une variété d'autres paramètres, y compris, mais sans s'y limiter: la microscopie à visualiser les bactéries fixées aux cellules des algues et des changements dans la morphologie des cellules d'algues; formation de colonies bactériennes unitaires (ufc) chefs d'accusation; et cytométrie de flux pour le nombre de cellules d'algues et des sous-populations d'identification.
Protocol
Representative Results
Discussion
La croissance des algues dans un format miniaturisé.
La miniaturisation des cultures d'algues à un volume de culture de 1 ml dans une plaque de microtitration permet la réplication au sein d'une expérience à être augmentée. Il est important de veiller à l'algue est en bonne santé tout au long d'une expérience; effectuer une courbe de croissance (Figure 2), en utilisant le format de microplaques pour évaluer divers médias algues, afin d'assurer le…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
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