Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Espectroscopia de força atômica é uma ferramenta ideal para estudar moléculas em superfícies e interfaces. Um protocolo experimental para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais de forma covalente para uma ponta de AFM é apresentado. Ao mesmo tempo, a ponta de AFM é passivado para evitar interacções não específicas entre a ponta e o substrato, o que é um pré-requisito para estudar moléculas individuais ligados à ponta de AFM. As análises para determinar a força de adesão, o comprimento de aderência, e a energia livre destas moléculas em superfícies sólidas e bio-interfaces são pouco apresentados e referências externas para leitura são fornecidos. Exemplos são as moléculas a polytyrosine poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoyl–sn-glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas são dessorvida a partir de diferentes superfícies como CH 3 -SAMs, hidrogénio terminada diamante e suportado bicamadas lipídicas sob várias condições do solvente. Finalmente, ovantagens da força espectroscópicas experiências de moléculas individuais são discutidas, incluindo meios para decidir se verdadeiramente uma única molécula tem sido estudada no experimento.
Introduction
Ao longo dos últimos 30 anos, microscopia de força atômica (AFM) acabou por ser uma técnica valiosa imagem para estudar biológicos 1,2 e sintéticas 3 materiais e superfícies, uma vez que fornece resolução espacial molecular em todas as três dimensões e pode ser operado em vários solvente ambientes. Além disso, a força molécula espectroscopia AFM-single (SMFS) permite medir forças que vão desde o PN a μN regime e deu uma visão sem precedentes por exemplo em proteína dobrar 4,5, física polímero 6-8, e interação molécula de superfície única 9 – 12 .A lógica por trás estudar moléculas individuais, em vez de um conjunto de moléculas é para evitar efeitos que muitas vezes mascaram eventos raros ou estados moleculares escondidos em média. Além disso, um grande número de parâmetros moleculares, tais como o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adesão, etc., podem serobtida. Este é detalhado nos exemplos abaixo. Numa experiência típica AFM-SMFS, a molécula de sonda é acoplada a uma ponta muito afiada através de uma molécula ligante. A ponta em si está localizado na extremidade de um braço de suporte flexível. Se a ponta é colocada em contacto com a superfície da molécula de sonda irá interagir com esta superfície. Observando-se a deflexão do braço de suporte à retracção da ponta, a força, e, por conseguinte, a energia livre, para separar a molécula de superfície pode ser determinada. Para obter estatísticas significativas, um grande número de chamadas curvas força-distância tem que ser adquirido. Além disso, para ter verdadeiros experimentos única molécula (isto é, utilizando uma e a mesma molécula sonda ao longo da duração de todo o experimento) a molécula sonda deve ser acoplado de forma covalente à ponta de AFM. Aqui, um protocolo experimental para a funcionalização cantilever com uma única molécula através de uma ligação covalente é apresentado. A única molécula ou pode ser acoplada por via de um grupo amino ou um tiol grupo para a ponta do AFM. O processo de conjugação pode ser realizada numa ampla variedade de solventes orgânicos e aquosos () para ter em conta as propriedades de solvatação dos polímeros usados.
Na primeira parte, um protocolo geral para ligar covalentemente uma molécula única ("molécula sonda") através de uma molécula ligante de uma ponta de AFM é descrito. Para este fim, NHS- orgânico ou maleimida-química é utilizado 13. Junto com o protocolo por três moléculas de exemplo, os processos de aquisição de dados e análise de dados são descritos e referências para leitura são fornecidos. Os exemplos de moléculas são: o (linear) tirosina polímero, o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA lipídica. Isto inclui ligeiras variações do protocolo, por exemplo, para ligar covalentemente cisteínas. Além disso, uma secção dedicada à preparação de superfícies diferentes, tais como uma superfície de diamante, um CH3 montado -auto-monocamada e bicamadas lipídicas. Essas interfaces tem proven ser boas referências e exemplos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante as últimas décadas, os experimentos única molécula ter fornecido informações sem precedentes sobre mecanismos moleculares e acabou por ser uma abordagem de valor inestimável em ciências da vida e além. Para alcançar bons e estatísticas significativas de experiências SMFS, de preferência uma e a mesma molécula é usado ao longo de todo o decurso da experiência. Em contraste com as experiências com conjuntos de moléculas, as experiências SMFS são capazes de detectar eventos raros e estados molec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
Riferimenti
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