Anvendelse af et High-throughput<em> In vitro</em> Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm

Summary

Målet med denne metoder papir er at beskrive anvendelsen af ​​et mikrofluidsystem for udviklingen af ​​multi-arter biofilm, der indeholder arter, typisk identificeret i human supragingival plak. Metoder til at beskrive biofilm arkitektur, biofilm levedygtighed, og en tilgang til høst biofilm for kultur-afhængige eller kultur-uafhængige analyser fremhævet.

Abstract

Der er få high-throughput in vitro systemer, som fremmer udviklingen af flere arter biofilm, der indeholder mange arter almindeligvis påvises inden in vivo orale biofilm. Endvidere et system, der anvender naturligt humant spyt som næringskilde, i stedet for kunstige medier, er særligt ønskeligt for at støtte ekspressionen af cellulære og biofilm-specifikke egenskaber, der efterligner in vivo samfund. Vi beskriver en metode til udvikling af flere arter orale biofilm, som er sammenlignelige med hensyn til artssammensætning, at supragingival plak, under betingelser svarende til det menneskelige mundhulen. Konkret vil dette metoder artikel beskriver, hvordan et kommercielt tilgængeligt mikrofluidsystem kan tilpasses for at fremme udviklingen af ​​flere arter orale biofilm stammer fra og dyrkes i samlet spyt. Endvidere kan en beskrivelse af, hvordan systemet anvendes i forbindelse med en confocal laser scanning mikroskop for at generere 3D-biofilm rekonstruktioner til arkitektoniske og levedygtighed analyser vil blive præsenteret. I betragtning af den brede mangfoldighed af mikroorganismer, der vokser inden biofilm i mikrofluidsystem (herunder Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella og Porphyromonas), vil en protokol også blive præsenteret som beskriver, hvordan man høste biofilm celler til yderligere subkultur eller DNA-ekstraktion og analyse. Grænserne for både microfluidic biofilm, og de nuværende state-of-the-art data analyser vil blive behandlet. I sidste ende, er det forudset, at denne artikel vil give en baseline teknik, der vil forbedre studiet af orale biofilm og støtte i udviklingen af ​​yderligere teknologier, der kan integreres med den mikrofluid platform.

Introduction

Biofilm er arkitektonisk komplekse samfund af bakterier, som sammendrages på overflader ^1. Disse samfund indeholder typisk mange arter, der interagerer med hinanden i biofilmen ^2. Mundtlige biofilm, de mest visuelt iøjnefaldende er plak, er et vedvarende problem i mennesker og deres ukontrollerede udviklingsresultater i frembringelsen af taksonomisk forskellige multi-arter samfund ^3. Komponenten bakterier af disse forskelligartede samfund kan være op til 1.000 gange mere modstandsdygtige over for antibiotika end deres frit svævende (planktoniske) modstykker ^4-6. Manglende behandling af disse orale biofilm samfund, som kan forårsage caries og paradentose, har resulteret i en betydelig offentlig sundhed byrde: over 500 millioner besøg hos tandlægen kontor om året i USA, og en ca. 108 milliarder dollar til at behandle eller forebygge periodontal sygdom og caries ^7.

indhold ">" Mens mange mikrobiologer fortaler studerer mikrobiel opførsel under naturlige forhold, nogle af dem gør det. Det skyldes, at deres moral for at overvinde de vanskeligheder, konstant undergravet af den attraktive nem at arbejde med laboratorie kulturer. "-Smith ^8.

På nuværende tidspunkt er oral biofilm forskning hjælp af en række in vivo og in vitro metoder, hver med deres egne fordele og ulemper ^9,10. In vitro metoder bruger ofte model biofilm systemer, der er forholdsvis nem at sætte op, men kan mangle klinisk / virkelige verden relevans ^10,11. In vivo metoder typisk afhængige dyremodelsystemer der kan reproducere visse aspekter af den menneskelige orale miljø, men igen lider begrænsninger på grund af forskelle i anatomi, fysiologi, mikrobiologi og immunologi mellem dyr og mennesker ^{12, 13..} Det skal bemærkes, at oral biofilmkan også udvikles på emaljeoverflader afholdt i en stent i munden på frivillige forsøgspersoner, men denne fremgangsmåde er i øjeblikket relativt dyrt og arbejdskrævende ^14,15. I sidste ende, er nye midler eller teknologier til forbedring tandpleje testet på mennesker under kontrollerede forsøg vilkår ¹¹ kliniske. På nuværende tidspunkt er en ofte brugt modus operandi for at identificere og evaluere nye tandpleje midler er først at udføre laboratorieundersøgelser for at skelne den potentielle effekt, og derefter udføre dyreforsøg og "markforsøg", der beskæftiger klinikere at vurdere succes teknologi ^{9, 16,17.} Desværre laboratorieundersøgelser har tendens til at stole på modelsystemer, der optager en stor fodaftryk, er teknologisk udfordrende at bruge, og indeholder ofte forenklede samfund af ét eller højst nogle få arter at udlede potentielle virkelige verden betyder ^10,18. Eftersom tandplak biofilm indeholde flere arter og form rundex strømmende spyt miljø, udvikling biofilm, der indeholder en eller nogle få arter i kunstig medier er usandsynligt at generere samfund, der opfører sig på en måde svarende til dem i den virkelige verden scenario ^10,19. For at løse den tid, omkostninger, uddannelseskrav, og de ​​fattige repræsentative karakter af laboratoriemodel biofilm systemer i forhold til den virkelige verden miljø, vi for nylig udviklet en høj kapacitet og miljømæssigt germane biofilm ^20, (figur 1). Systemet fordele ved brugen af ​​cellefrit puljet humant spyt (CFS) som medium og ubehandlet puljet human bakteriel celle-holdige spyt (CCS) som inokulum. Unikt, at systemet også kombinerer mikrofluid teknologi, et konfokalt laser scanning mikroskop, og kultur-uafhængige bakteriel mangfoldighed analyse teknologi. Således modelsystemet er miljømæssigt germane (ved hjælp af spyt som et inokulum til at vokse flere arter biofilm på 37 ° C i filtersteriliseret flyderspyt) og de ​​mundtlige biofilm indeholder arter (herunder Streptococcus, Neisseria, Veillonella og Porphyromonas arter) i mængderne repræsentative for dem, der findes i begyndelsen supragingival plaque ^20.

Når man overvejer at dette arbejde beskriver brugen af ​​det nyudviklede model-system, skal man være særlig opmærksom på sammenlægningen af ​​en konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) mikrofluidik, og mangfoldighed analyseteknologier kultur-uafhængig. Foreningen af ​​disse teknologier, som vores forskningsgruppe var tilsigtet og ikke kun tilføjer en high-throughput evne til det nyudviklede model-system, men giver også mulighed spørgsmål at blive spurgt, der ikke kunne være let løses før med andre systemer. Første CLSM har tydelige fordele frem for traditionelle mikroskopi da det giver mulighed for den tredimensionelle analyse af biofilm. Ofte glemmes, det er yderst vigtigt, da biofilm er heterogene with hensyn til artssammensætning og rumlig position samt de fysiologiske forhold pålægges forskellige geografiske steder i biofilmen ^6,21. I samråd med tredimensionel gengivelse software og billedanalyse software, biofilmen arkitektur, rumlige forhold mellem komponent arter, og omfanget af antimikrobiel drab kan analyseres ^22-24. Sådanne evner er ikke muligt ved hjælp af standard lystransmission eller epifluorescens mikroskopi. Dernæst har mikrofluidik fået særlig opmærksomhed med hensyn til mikrobiologi, da den gør det muligt at studere biofilm under omhyggeligt kontrollerede betingelser (flow, temperatur, pH, etc.) og kræver kun små mængder af væske ^25-27. Som et punkt i sammenligning, vokser en mundtlig biofilm i humant spyt i en flow-celle modelsystem (et system, der er velsagtens betragtes som den bærende model for mange orale biofilm undersøgelser) i 20 timer ved en lignende gennemstrømningshastighed og forskydning som der opnåsi en mikrofluidsystem kræver mindst 200 ml, i modsætning til 800 pi i mikrofluid anordning ^28-31. Således er en mikrofluid model biofilm system muliggør studiet af kvantitet begrænset materiale under definerede betingelser. Endelig er pyrosekventering teknologi blevet optimeret i de sidste ti år til at kræve kun små mængder af materiale til at foretage et fællesskab analyse og er tilstrækkelig alsidig at styre dybden af ​​sekventering at få identiteten af ​​selv sjældne biofilm arter. Brugen af denne teknologi, såsom bakteriel tag-kodet FLX amplikon pyrosekventering (bTEFAP), har gjort det muligt for relevante spørgsmål vedrørende økologi biofilm, der skal behandles ^32,33. Sådanne spørgsmål gennemsyret vanskeligheder i fortiden, når pyrosekventering var ikke tilgængelig på grund af den tid og de ​​omkostninger, der er nødvendige for at skabe plasmid biblioteker og de ​​komplekse teknologiske og analytiske trin, der kræves for at udlede data ^33,34. Selvfølgelig en stor fordel med kultur-uafhængig aptilgange, såsom pyrosekventering, er, at de bakterielle arter, der ikke kan dyrkes i isolation i konventionelle laboratorium medier (dvs. levedygtige, men ikke-dyrkbare arter) kan dyrkes og identificeres inden for modellen, og deres relative overflod i samfundet kvantificeret ^{35, 36} . Hvis du vil tilføje perspektiv, så tidligt som 1963 anslået afdøde Sigmund Socransky at ca. 50% af bakterierne i materiale isoleret fra det menneskelige orale gingival sprække ikke kunne dyrkes under anvendelse vækst laboratorieforhold ^37.

Formålet med denne metoder papir er at beskrive den tilgang til at udvikle orale flere arter biofilm i en mikrofluid (Bioflux) systemet kommercielt tilgængelige under: (i) betingelserne repræsentative for den menneskelige mundhule og (ii) med en artssammensætning og tæthed, som er sammenlignelig med supragingival plak. Desuden ved hjælp af både freeware og kommerciel software, fremhæve vi hvordan grundlæggende biofilmarkitektur foranstaltninger kan udledes CLSM data, med fokus på metoder til at kvantificere biofilm biomasse, ruhed, og levedygtighed (baseret på live / Dead farvning). Endelig er de nødvendige skridt til at høste biofilm materiale for mangfoldighed analyse af bTEFAP beskrevet.

Protocol

Den spyt indsamlingen protokollen beskrevet heri blev gennemgået af University of Michigan Institutional Review Board for menneske Research. BEMÆRK: Med hensyn til de institutionelle anmeldelser for menneske arbejde af denne type, bør forudgående ordninger og tilladelser vundet fra værtsinstitutionen. Især afhængig af institutionen, kan IRB eller etik godkendelse skal søges og godkendes, før spyt samling fra frivillige kan fortsætte. Som en hjælp til at udarbejde en ansøgning, kan en nyttig NIH algori…

Representative Results

3d rendering af biofilm Repræsentative resultater er vist i figur 3. Et nyttigt værktøj i Imaris software er mulighed for at undersøge hver skive af det indsamlede biofilm stakken og til at kombinere dem for at skabe tredimensionale rekonstruktioner. Desuden kan der tilsættes kunstige shadowing effekter for at hjælpe visuelt fortolke tredimensionale strukturer. De ydede biofilm kan være orienteret i alle retninger med forskellige forstørrels…

Discussion

Denne metoder fremhæves de grundlæggende trin, der kræves for at opsætte og køre et mikrofluidsystem på en sådan måde at give mulighed for udvikling af orale flere arter biofilm afledt fra puljet human spyt og dyrket i filtersteriliseret 25% poolet humant spyt. Approaches at karakterisere biofilm er givet, men det bør erindres, at disse beskrevne fremgangsmåder er modificerbare og yderligere teknologier, såsom for eksempel kan indføres pletter eller etiketter. Som et spørgsmål eksempel kunne man forestille…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)