Toepassing van een High-throughput<em> In Vitro</em> Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

Summary

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Abstract

Er zijn weinig high-throughput in vitro systemen die de ontwikkeling van multi-species biofilms die talrijke soorten gewoonlijk binnen in vivo orale biofilms gedetecteerd bevatten vergemakkelijken. Bovendien is een systeem dat natuurlijk humaan speeksel gebruikt als voedingsbron in plaats van kunstmatige media, bijzonder gewenst om de expressie van cellulaire en biofilm specifieke eigenschappen die de in vivo nabootsen gemeenschappen ondersteunen. We beschrijven een werkwijze voor de ontwikkeling van multi-species orale biofilms die vergelijkbaar zijn wat betreft samenstelling species, tandplak supragingivale, onder omstandigheden vergelijkbaar met de menselijke mondholte. Concreet zal dit werkwijzen artikel wordt beschreven hoe een in de handel verkrijgbaar microfluïdische systeem kan worden aangepast aan de ontwikkeling van multi-species orale biofilms ontleend vergemakkelijken en gekweekt in samengevoegd speeksel. Bovendien kan een beschrijving van het systeem in combinatie met een confocal laser scanning microscoop 3-D reconstructies biofilm voor architecturale en levensvatbaarheid analyses genereren gepresenteerd. Gezien de grote diversiteit van micro-organismen die groeien binnen biofilms in de microfluïdische systeem (met inbegrip van Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, en Porphyromonas), zal een protocol worden gepresenteerd die beschrijven hoe de biofilm cellen te oogsten voor verdere subcultuur of DNA-extractie en analyse. De grenzen van zowel de microfluïdische biofilm systeem en de huidige state-of-the-art data analyses zullen worden aangepakt. Uiteindelijk wordt voorzien dat dit artikel een basislijn techniek die de studie van orale biofilms verbeteren en helpen bij de ontwikkeling van aanvullende technologieën die kunnen worden geïntegreerd met de microfluïdische platform ontstaat.

Introduction

Biofilms zijn architectonisch complex gemeenschappen van bacteriën die worden geaggregeerd op oppervlakken ^1. Deze gemeenschappen bevatten doorgaans talrijke soorten die interageren met elkaar binnen de biofilm ^2. Orale biofilms, de meest visueel opvallende zijn tandplaque, een aanhoudend probleem bij mensen en ongecontroleerd ontwikkeling resulteert in het genereren van taxonomisch diverse multispeciesvisserij gemeenschappen ^3. De component bacteriën van deze verschillende gemeenschappen kan tot 1.000 keer meer resistent tegen antibiotica dan hun vrij zwevende (planktonische) tegenhangers ^4-6. Het negeren van deze orale biofilm gemeenschappen, die cariës en parodontale aandoeningen kan veroorzaken te behandelen, heeft geresulteerd in een aanzienlijke last voor de volksgezondheid: meer dan 500 miljoen bezoeken aan de tandarts kantoor per jaar in de VS, en een ongeveer $ 108.000.000.000 te behandelen of parodontale voorkomen ziekte en cariës ^7.

content ">" Terwijl veel microbiologen pleiten microbiële gedrag onder natuurlijke omstandigheden, op een paar van hen doen. Dit komt omdat hun moraal voor het overwinnen van de moeilijkheden wordt voortdurend ondermijnd door het aantrekkelijke gemak van het werken met het laboratorium culturen. "-Smith ^8.

Op dit moment wordt orale biofilm onderzoek uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid van in vivo en in vitro benaderingen, elk met hun eigen voor- en nadelen ^9,10. In vitro benadert vaak gebruik van model biofilm systemen die relatief eenvoudig op te zetten, maar kan klinische missen / real-world relevantie ^10,11. In vivo technieken vertrouwen typisch op diermodellen dat bepaalde aspecten van het humane orale milieu reproduceren, maar ook last van beperkingen door verschillen in anatomie, fysiologie, microbiologie en immunologie tussen mens en dier ^{12, 13.} Opgemerkt moet worden dat orale biofilmskan ook worden ontwikkeld op glazuuroppervlakken gehouden in een stent binnen de monden van menselijke vrijwilligers, maar deze benadering is nog relatief duur en arbeidsintensief ^14,15. Uiteindelijk roman agenten of technologieën om mondzorg te verbeteren, worden getest bij mensen onder gecontroleerde klinische studie omstandigheden ^11. Momenteel vaak gebruikte werkwijze voor het identificeren en evalueren van nieuwe orale gezondheidszorg agentia eerst uitgevoerd laboratoriumonderzoek potentiële werkzaamheid onderscheiden, en dierstudies en "veldproeven" die clinici gebruiken om het succes van de techniek ⁹ evalueren ^{voeren, 16,17.} Helaas laboratoriumstudies neiging te vertrouwen op modelsystemen dat een groot voetafdruk delen en technologisch moeilijk te gebruiken, en bevatten vaak vereenvoudigde gemeenschappen een of hoogstens enkele soort mogelijke echte betekenis ^10,18 ontlenen. Gezien het feit dat tandplaque biofilms bevatten meerdere soorten en vorm in een complex stromen speeksel milieu, ontwikkelen biofilms die bevatten of enkele species in kunstmatige media waarschijnlijk gemeenschappen die zich gedragen op een soortgelijke wijze als die in een real-world scenario ^10,19 genereren. Om de tijd, kosten, opleidingseisen, en de arme representatieve karakter van het laboratorium model biofilm systemen vergeleken met de echte wereld milieu aan te pakken, recent ontwikkelde wij een hoge doorvoer en milieuvriendelijk germane biofilm systeem ²⁰ (figuur 1). Het systeem bovendien gebruik van celvrije gepoolde humaan speeksel (CFS) als medium en onbehandelde gepoolde humane bacteriële cellen speeksel (CCS) als inoculum. Uniek is dat het systeem combineert ook microfluïdische technologie, een confocale laser scanning microscoop, en de cultuur-onafhankelijke bacteriële diversiteit analyse technologie. Dus het modelsysteem is milieuvriendelijk germaan (met speeksel als inoculum multi-species biofilms groeien 37 ° C in steriel gefiltreerd stromendespeeksel) en de orale biofilms bevatten soorten (waaronder Streptococcus, Neisseria, Veillonella en Porphyromonas soorten) in abundanties vertegenwoordiger van die gevonden in de vroege supragingivale plaque ^20.

Wanneer men bedenkt dat dit werk beschrijft het gebruik van de nieuw ontwikkelde model systeem, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de samensmelting van een confocale laser scanning microscoop (CLSM) microfluidics, en de cultuur-onafhankelijke diversiteit analyse technologieën. De vereniging van deze technologieën door onze onderzoeksgroep was opzettelijk en voegt niet alleen een high-throughput mogelijkheid om de nieuw ontwikkelde model systeem, maar maakt het ook mogelijk vragen te stellen die niet gemakkelijk kan worden aangepakt voordat met andere systemen. Allereerst CLSM heeft duidelijke voordelen boven traditionele microscopie het zorgt voor de driedimensionale analyse van biofilms. Vaak unappreciated, dit is zeer belangrijk biofilms heterogeen with betrekking tot soorten en ruimtelijke positie en de fysiologische omstandigheden opgelegd op verschillende ruimtelijke locaties binnen de biofilm ^6,21. In overleg met de drie-dimensionale rendering software en software voor beeldanalyse, de biofilm architectuur, ruimtelijke relaties tussen component soorten, en de omvang van antimicrobiële doden kan worden geanalyseerd ^22-24. Dergelijke vaardigheden zijn niet mogelijk met behulp van standaard uitgezonden licht of epifluorescentiemicroscopie. Vervolgens heeft microfluïdische aandacht vergaard op het gebied van microbiologie omdat dit aan de studie van biofilms onder zorgvuldig gecontroleerde omstandigheden (stroomsnelheid, temperatuur, pH, etc.) en slechts kleine hoeveelheden vloeistof ^25-27 vereist. Als een punt van vergelijking, groeit een orale biofilm in het menselijk speeksel binnen een stroom cel modelsysteem (een systeem dat aantoonbaar wordt beschouwd als de steunpilaar model voor veel orale biofilm studies) voor 20 uur bij een vergelijkbaar debiet en afschuiving als dat bereiktin een microfluïdische systeem vereist ten minste 200 ml, in tegenstelling tot 800 gl in de microfluïdische inrichting ^28-31. Zo, een microfluïdische model biofilm systeem maakt het mogelijk de studie van de hoeveelheid beperkt materiaal onder bepaalde omstandigheden. Tenslotte is Pyrosequencing technologie geoptimaliseerd in de afgelopen tien jaar slechts geringe hoeveelheden materiaal nodig om een ​​gemeenschapsanalyse voeren en voldoende veelzijdig diepte sequencing besturen om de identiteit van zelfs zeldzame soorten biofilm verkrijgen. Het gebruik van deze technologie, zoals bacteriële-tag gecodeerd FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP), heeft het mogelijk gemaakt voor de pertinente vragen over de ecologie van biofilms worden aangepakt ^32,33. Dergelijke vragen doordrongen problemen in het verleden als Pyrosequencing niet beschikbaar vanwege de tijd en kosten om plasmide bibliotheken en complexe technologische en analytische stappen die nodig zijn om gegevens ^33,34 afleiden maken. Natuurlijk, een groot voordeel met cultuur-onafhankelijke apderingen, zoals pyrosequencing, is dat de bacteriële soorten die niet kunnen worden gekweekt afzonderlijk in conventionele laboratoriummedia (dwz levensvatbare maar niet kweekbare soorten) kunnen worden gekweekt en geïdentificeerd in het modelsysteem en hun relatieve abundantie in de gemeenschap gekwantificeerde ^{35, 36} . Perspectief, al 1963 toe, wijlen Sigmund Socransky geschat dat ongeveer 50% van de bacteriën in geïsoleerde delen van de humane orale gingivale spleet niet kunnen worden gekweekt met behulp van laboratorium groeiomstandigheden ^37.

Het doel van deze methoden paper is om de aanpak te beschrijven om mondelinge multi-species biofilms in een commercieel verkrijgbaar microfluïdisch (Bioflux) systeem onder te ontwikkelen: (i) de voorwaarden vertegenwoordiger van de menselijke mondholte en (ii) met een soortensamenstelling en overvloed die is vergelijkbaar met subgingivale plaque. Bovendien, met behulp van zowel freeware en commerciële software, we benadrukken hoe basic biofilmarchitectuur maatregelen kan worden afgeleid uit CLSM gegevens, met een focus op de aanpak van biofilm biomassa, ruwheid, en de levensvatbaarheid te kwantificeren (op basis van Levend / Dead vlekken). Tot slot, de stappen die nodig zijn om biofilm materiaal voor diversiteit analyse oogsten door bTEFAP worden beschreven.

Protocol

Het speeksel collectie protocol hierin beschreven werd beoordeeld door de Universiteit van Michigan Institutional Review Board for Human Onderwerp Research. OPMERKING: Met betrekking tot de institutionele reviews voor menselijke subject werk van dit type, moet vooraf afspraken en machtigingen worden vergaard uit de gastinstelling. In het bijzonder, afhankelijk van de instelling, IRB of ethiek goedkeuring zou moeten worden gezocht en goedgekeurd voordat het speeksel collectie van menselijke vrijwilligers kunnen ga…

Representative Results

3D-rendering van biofilms Representatieve resultaten zijn getoond in figuur 3. Een nuttig instrument IMARIS software is de mogelijkheid om elk segment van de verzamelde biofilm stack onderzoeken en combineren driedimensionale reconstructies gemaakt. Bovendien kunnen kunstmatige schaduweffecten worden toegevoegd om visueel te interpreteren driedimensionale structuren. Het gesmolten biofilms kunnen gericht worden in elke richting met verschillende ver…

Discussion

Deze methoden paper belicht de fundamentele stappen die nodig zijn om te installeren en uitvoeren van een microfluïdische systeem op een manier te zorgen voor de ontwikkeling van mondelinge multi-species biofilms afgeleid van gepoolde humane speeksel en gekweekt in een filter gesteriliseerde 25% gepoold menselijk speeksel. Benaderingen van de biofilm kenmerken worden gegeven, maar het moet niet vergeten dat deze beschreven benaderingen aanpasbaar en aanvullende technologieën zoals, bijvoorbeeld, kunnen vlekken of labe…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)