מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.
יש תפוקה גבוהה כמה במערכות חוץ גופית שתקלנה על הפיתוח של biofilms רב-מינים המכילים מינים רבים מזוהים בדרך כלל בתוך in vivo biofilms האוראלי. יתר על כן, מערכת המשתמשת ברוק אנושי טבעי כמקור התזונתי, במקום תקשורת המלאכותית, במיוחד רצויה על מנת לתמוך בביטוי של מאפיינים סלולריים וbiofilm ספציפי המחקים את in vivo הקהילות. אנו מתארים שיטה לפיתוח רב-מינים biofilms האוראלי כי הם דומים, ביחס להרכב מינים, לsupragingival רובד שיניים, בתנאים דומים לחלל הפה האנושי. באופן ספציפי, מאמר שיטות זה יתאר כיצד מערכת microfluidic זמינה מסחרי יכולה להיות מותאם כדי להקל על הפיתוח של biofilms האוראלי רב-מינים שמקורם וגדלה בתוך רוק נקווה. יתר על כן, תיאור של איך המערכת יכול לשמש בשילוב עם confocaמיקרוסקופ סריקת לייזר l לייצר שחזורי biofilm 3-D עבור ניתוחי כדאיות אדריכליים ויוצג. בהתחשב במגוון הרחב של מיקרו-אורגניזמים הגדלים בתוך biofilms במערכת microfluidic (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, וPorphyromonas), פרוטוקול יהיה גם הציג מתאר כיצד לקצור את תאי biofilm לתת-תרבות נוספת או מיצוי DNA וניתוח. גבולות הן את מערכת biofilm microfluidic ומנתח את הנתונים הנוכחיים מדינה-of-the-האמנות יטופלו. סופו של דבר, הוא חזה שמאמר זה יספק טכניקה בסיסית שתשפר את המחקר של biofilms האוראלי ולסייע בפיתוח של טכנולוגיות נוספות שיכול להיות משולבת עם פלטפורמת microfluidic.
Biofilms הם ארכיטקטוני קהילות מורכבות של חיידקים המצטברות על משטחי 1. קהילות אלה מכילים בדרך כלל מינים רבים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני בתוך biofilm 2. biofilms האוראלי, רובד השיניים להיות ביותר מבחינה ויזואלית הבולט, הוא בעיה מתמשכת בבני אדם ותוצאות הפיתוח בלתי מבוקרות שלהם בדור של קהילות רב-מינים טקסונומית מגוונות 3. חיידקי המרכיב של קהילות המגוונות אלה יכולים להיות עד 1,000 פעמים יותר עמידות לאנטיביוטיקה מאשר עמיתיהם משתנה חופשיים (פלנקטון) 4-6. כישלון לטיפול ביישובים אלה אוראליים biofilm, אשר יכול לגרום לעששת ומחלת חניכיים, הביא נטל משמעותי על בריאות ציבור: למעלה מ -500 מיליון ביקורים במשרד רופא השיניים בשנה בארה"ב, וכ -108 מליארד דולרים לטיפול באו למנוע חניכיים מחלה ועששת 7.
תוכן ">" בעוד מיקרוביולוגים רבים תומכים בלימוד התנהגות של חיידקים בתנאים טבעיים, כמה מהם לעשות זאת. סיבה לכך הוא המורל שלהם להתגבר על הקשיים מתפוגג ללא הרף על ידי הקלות אטרקטיביות של עבודה עם תרבויות מעבדה. "-Smith 8.נכון לעכשיו, מחקר biofilm אוראלי מתבצע תוך שימוש במגוון של in vivo ובגישות חוץ גופית, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משל 9,10. במבחנה גישות לעתים קרובות משתמש במערכות biofilm מודל שהנן קלים יחסית להגדיר אבל ייתכן חוסר קליני / רלוונטי בעולם האמיתי 10,11. בvivo גישות בדרך כלל להסתמך על מערכות מודל חיה שעלול להתרבות היבטים מסוימים של סביבת הפה האנושית, אבל שוב סובלים ממגבלות בשל הבדלים באנטומיה, פיזיולוגיה, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה בין חיות ובני האדם 12, 13. יש לציין כי biofilms האוראלייכול להיות גם שפותח על משטחי אמייל שנערכו בסטנט בתוך הפה של מתנדבים אנושיים, אבל גישה זו היא כיום יחסית יקרה ועתירת עבודה 14,15. סופו של דבר, סוכנים או טכנולוגיות לשיפור בריאות פה רומן נבדקים בבני אדם בתנאי ניסוי קליניים מבוקרים 11. נכון לעכשיו, דרך פעולה לעתים קרובות נעשה שימוש לזיהוי והערכת סוכני בריאות פה חדשים היא לבצע מחקרי המעבדה ראשון להבחין ביעילות פוטנציאלית, ולאחר מכן לבצע מחקרים בבעלי חיים ו" שדה ניסויים "שמעסיקים רופאים להעריך את ההצלחה של הטכנולוגיה 9, 16,17. למרבה הצער, מחקרי מעבדה נוטים להסתמך על מערכות מודל שמעסיקות את טביעת רגל גדולה, הם מבחינה טכנולוגית מאתגרים לשימוש, ולעתים קרובות מכיל פשוטים קהילות של אחד או לכל היותר כמה מינים לגזור עולם אמיתי פוטנציאלי כלומר 10,18. בהתחשב בכך שbiofilms רובד שיניים מכיל מינים וצורה מרובים בcomplלשעבר זורם סביבת רוק, פיתוח biofilms המכיל אחד או כמה מינים בתקשורת מלאכותית סביר כדי ליצור קהילות שמתנהגות באופן דומה לאלה בתרחיש של עולם אמיתי 10,19. כדי לטפל בזמן, העלות, דרישות הכשרה, ואת אופי הנציג הירוד של מערכות biofilm מודל מעבדה בהשוואה לסביבה בעולם האמיתי, לאחרונה פיתחו מערכת biofilm שמקורן הסביבה 20 (איור 1) תפוקה וגבוהה. יתרונות המערכת מהשימוש ברוק תא ללא במאגר אנושי (CFS) כמו רוק בינוני ולא מטופל ונקווה אדם בקטריאלי המכיל תא (CCS) כבידוד. באופן ייחודי, המערכת משלבת גם טכנולוגית microfluidic, מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal, וטכנולוגיה ניתוח מגוון חיידקי תרבות עצמאית. לפיכך, מערכת המודל הוא רוק שמקורן הסביבה (באמצעות כבידוד לגדול biofilms רבי מינים ב 37 ° C בזורם מעוקר מסנןרוק) וbiofilms האוראלי מכילים מינים (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, ומיני Porphyromonas) בנציג שכיחותם של אלה שנמצאו ברובד supragingival המוקדם 20.
כאשר בהתחשב בכך שעבודה זו מתארת את השימוש במערכת המודל חדש שפותחה, תשומת לב מיוחדת יש לתת למיזוג של מיקרופלואידיקה מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), וטכנולוגיות ניתוח גיוון תרבות עצמאית. האיחוד של טכנולוגיות אלה על ידי קבוצת המחקר שלנו היה מכוון ולא רק מוסיף יכולת תפוקה גבוהה למערכת המודל החדש שפותחה, אלא גם מאפשר לי שאלות שיש לשאול שלא יכולות להיות בקלות לטפל לפני עם מערכות אחרות. ראשית, יש CLSM יתרונות ברורים על פני מיקרוסקופיה המסורתית שכן היא מאפשרת לניתוח תלת-ממדי של biofilms. לעתים קרובות שלא מעריכים, זה חשוב מאוד כbiofilms הוא שנינות הטרוגניתכבוד h להרכב מינים ומיקום המרחבי, כמו גם את התנאים הפיסיולוגיים שהוטל במקומות שונים במרחבי biofilm 6,21. בתיאום עם תוכנה תלת ממדי טיוח ותוכנת ניתוח תמונה, ארכיטקטורת biofilm, יחסים מרחביים בין מיני רכיב, והרג מיקרוביאלית מידה ניתן לנתח 22-24. יכולות כאלה אינן אפשריות באמצעות אור רגיל שמועבר או מיקרוסקופיה epifluorescence. בשלב הבא, מיקרופלואידיקה זכתה לתשומת לב מיוחדת בתחום מיקרוביולוגיה כפי שהיא מאפשרת המחקר של biofilms בתנאים מבוקרים היטב (זרימה, טמפרטורה, pH, וכו '), ורק דורשת כמויות קטנות של 25-27 הנוזלי. כנקודת השוואה, גידול biofilm אוראלי ברוק אנושי בתוך מערכת מודל תא זרימה (מערכת שנחשבת למודל התווך למחקרים רבים biofilm אוראליים לטעון) במשך 20 שעות בספיקה וגזירה דומות לזה שהושגבמערכת microfluidic דורש לפחות 200 מיליליטר, בניגוד ל -800 μl במכשיר microfluidic 28-31. לפיכך, מערכת biofilm מודל microfluidic מאפשרת העיון בחומר מוגבל כמות בתנאים מוגדרים. לבסוף, טכנולוגית pyrosequencing כבר מותאמת בעשור האחרון לדורשת רק כמויות קטנות של חומר לבצע ניתוח קהילה ומספיק תכליתי כדי לשלוט עומק של רצף כדי לקבל את הזהות של מיני biofilm אפילו נדירים. השימוש בטכנולוגיה זו, כגון pyrosequencing חיידקים בקידוד תג FLX amplicon (bTEFAP), אפשר לשאלות רלוונטיות הנוגעות לאקולוגיה של biofilms לטפל 32,33. שאלות מסוג זה חדורים קשיים בעבר כאשר pyrosequencing לא היה זמין בגלל הזמן והעלויות הנדרשות ליצירת ספריות פלסמיד ונדרשו להפיק נתונים 33,34 צעדים טכנולוגיים ואנליטיות המורכבים. כמובן, יתרון גדול עם ap התרבות העצמאיתגישות, כגון pyrosequencing, היא שמיני חיידקים שלא ניתן לגדל בבידוד בתוך תקשורת מעבדה הקונבנציונלית (מינים ברי קיימא כלומר אבל אינם ראויים לעיבוד חקלאי) ניתן לגדל וזיהו בתוך מערכת המודל והשפע היחסי שלהם בקהילה לכמת 35, 36 . כדי להוסיף נקודת מבט, מוקדם ככל 1963, זיגמונד Socransky מאוחר ההערכה היא כי כ -50% מהחיידקים בחומר המבודדים מנקיק החניכיים הפה האנושי לא יכולים להיות מתורבת באמצעות תנאי גידול מעבדה 37.
מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את הגישה לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים במערכת microfluidic זמינה מסחרי (Bioflux) תחת: נציג תנאים (i) של חלל הפה האנושי ו( ii) עם הרכב מינים ושפע ש דומה לשלט supragingival. יתר על כן, שימוש בשתי תוכנות חופשית ומסחריות, אנו מדגישים biofilm איך בסיסיניתן לגזור אמצעי ארכיטקטורה מנתוני CLSM, עם דגש על גישות לכמת ביומסה biofilm, חספוס, ואת כדאיות (המבוסס על צביעה חי / מת). לבסוף, את הצעדים הנדרשים כדי לקצור חומר biofilm לניתוח גיוון ידי bTEFAP מתוארים.
נייר שיטות זה מדגיש הנדרש להקמת השלבים הבסיסיים ולהפעיל מערכת microfluidic באופן שיאפשר לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים נגזר מרוק אנושי ונקווה וגדל ב- 25% רוק אנושי ויקווה-מעוקר מסנן. מקבלות גישות לאפיין את biofilm אך יש לזכור כי גישות המתוארות אלה הן טכנולוגיות לשינוי ונוספות כ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים ויליאם Nance (אוניברסיטת מישיגן) לעזרה בגיבוש פרוטוקולי צמיחת biofilm וג'ון בטיסטה (Fluxion, סן פרנסיסקו, קליפורניה) לקבלת ייעוץ בנושאים טכנולוגיים הנוגעים למערכת Bioflux. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (NIH: R21DE018820 לAHR) ואוניברסיטת מישיגן קרנות הזנק לAHR
SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
SOFTWARE | ||
Bioflux dedicated software | Bioflux | |
Imaris | Bitplane | |
Leica SPE | Leica | |
ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) |