L'uso di un high-throughput<em> In Vitro</em> Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

Summary

L'obiettivo di questo metodo è di descrivere l'uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l'architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati.

Abstract

Ci sono pochi-throughput elevato di sistemi in vitro che facilitano lo sviluppo di biofilm multispecie che contengono numerose specie comunemente rilevati all'interno di biofilm orali in vivo. Inoltre, un sistema che utilizza saliva umana naturale come fonte di nutrienti, invece di mezzi artificiali, è particolarmente auspicabile per sostenere l'espressione di proprietà cellulari e specifici biofilm che imitano le comunità in vivo. Noi descriviamo un metodo per lo sviluppo di multispecie biofilm orali che sono paragonabili, rispetto alla composizione delle specie, per sopragengivale placca dentale, in condizioni analoghe a cavità orale umana. In particolare, questo articolo metodi descriverà come un sistema microfluidico disponibile in commercio può essere adattato per facilitare lo sviluppo di multispecie biofilm orali derivate da e coltivata all'interno saliva pool. Inoltre, una descrizione di come il sistema può essere utilizzato in congiunzione con un confocalaser microscopio a scansione l per generare 3-D ricostruzioni biofilm per analisi di architettura e vitalità saranno presentati. Data la grande diversità dei microrganismi che si sviluppano all'interno di biofilm nel sistema microfluidica (compreso Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, e Porphyromonas), un protocollo verrà presentato anche che descrive come raccogliere le cellule biofilm per ulteriori subcultura o l'estrazione del DNA e l'analisi. Verranno trattati i limiti sia del sistema biofilm microfluidica e le analisi attuali state-of-the-art di dati. In ultima analisi, è previsto che tale articolo fornisce una tecnica di base in grado di migliorare lo studio dei biofilm orali e contribuire allo sviluppo di tecnologie aggiuntive che possono essere integrate con la piattaforma microfluidica.

Introduction

I biofilm sono architettonicamente comunità complesse di batteri che sono raggruppati sulle superfici ^1. Queste comunità in genere contengono numerose specie che interagiscono tra loro all'interno del biofilm ^2. Biofilm orali, il più visivamente evidente essendo la placca dentale, sono un problema persistente negli esseri umani e dei loro risultati di sviluppo incontrollato della generazione di tassonomicamente diverse comunità multi-specie ^3. I batteri che compongono queste diverse comunità possono essere fino a 1.000 volte più resistenti agli antibiotici rispetto ai loro (planctonici) controparti free-floating ^4-6. Il mancato trattamento di queste comunità biofilm orali, che possono causare carie e malattia parodontale, ha portato ad un notevole onere di salute pubblica: oltre 500 milioni di visite dal dentista all'anno negli Stati Uniti, e uno di circa 108.000 milioni dollari per trattare o prevenire parodontale malattia e carie dentale ^7.

content ">" Mentre molti microbiologi sostengono lo studio del comportamento microbica in condizioni naturali, alcuni di loro lo fanno. Questo perché la loro morale per superare le difficoltà è costantemente minato dalla facilità attraente di lavorare con culture di laboratorio. "-Smith ^8.

Allo stato attuale, la ricerca biofilm orale è condotta utilizzando una varietà di in vivo e in vitro approcci, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi ^9,10. In vitro avvicina spesso utilizzano sistemi biofilm modello che sono relativamente facili da impostare, ma possono mancare clinico / rilevanza nel mondo reale ^10,11. In vivo approcci fanno affidamento sui sistemi modello animale che possono riprodurre alcuni aspetti dell'ambiente orale umana, ma ancora una volta soffrire di limitazioni dovute a differenze di anatomia, fisiologia, microbiologia e immunologia tra animali ed esseri umani ^{12, 13.} Va notato che biofilm oralipuò anche essere sviluppato su superfici smaltate detenuti in uno stent all'interno delle bocche di volontari umani, ma questo approccio è attualmente relativamente costoso e ^14,15 alta intensità di manodopera. In ultima analisi, nuovi agenti o tecnologie per migliorare l'assistenza sanitaria per via orale sono testati sugli esseri umani in condizioni di studi clinici controllati ^11. Allo stato attuale, un modus operandi spesso utilizzato per identificare e valutare nuovi agenti sanitari orali è quello di eseguire studi di laboratorio prima di discernere potenziale efficacia, e quindi eseguire studi sugli animali e le "prove sul campo", che utilizzano i medici per valutare il successo della tecnologia ^{9, 16,17.} Purtroppo, studi di laboratorio tendono a fare affidamento su sistemi modello che occupano una grande impronta, sono tecnologicamente difficile da usare, e spesso contengono semplificati comunità di uno o al massimo un paio di specie di trarre il potenziale del mondo reale che significa ^10,18. Dato che biofilm di placca dentale contengono più specie e forma in un complex scorre ambiente salivare, sviluppando biofilm che contengono una o poche specie mezzi artificiale è improbabile generare comunità che si comportano in modo simile a quelle di un scenario reale ^10,19. Per affrontare il tempo, costi, requisiti di formazione, e la rappresentatività dei poveri sistemi biofilm modelli di laboratorio rispetto per l'ambiente del mondo reale, abbiamo recentemente sviluppato un elevato throughput e di biofilm germano ambientale ²⁰ (Figura 1). I vantaggi del sistema l'uso di pool saliva umana cell-free (CFS) come mezzo e non trattata pool saliva cellule contenenti batterica umana (CCS) come inoculo. Unicamente, il sistema combina la tecnologia microfluidica, un microscopio confocale a scansione laser, e la diversità batterica tecnologia cultura indipendente di analisi. Così, il sistema modello è attinente ambientale (utilizzando la saliva come inoculo di crescere biofilm multispecie a 37 ° C in sterilizzata per filtrazione, che scorresaliva) e biofilm orali contengono specie (tra cui Streptococcus, Neisseria, Veillonella, e specie Porphyromonas) in abbondanze rappresentante di quelle che si trovano nei primi mesi della placca sopragengivale ^20.

Quando si considera che questo lavoro descrive l'utilizzo del modello di sistema di nuova concezione, particolare attenzione deve essere data alla fusione di un microscopio a scansione laser confocale (CLSM) microfluidica, e le tecnologie della cultura indipendente di analisi diversità. L'unione di queste tecnologie da parte del nostro gruppo di ricerca è stato intenzionale e non solo aggiunge una capacità high-throughput per il sistema modello di nuova concezione, ma permette anche domande da porre che non potrebbero essere facilmente affrontati prima che con altri sistemi. In primo luogo, CLSM presenta evidenti vantaggi rispetto microscopia tradizionale in quanto consente l'analisi tridimensionale di biofilm. Spesso incompreso, questo è estremamente importante in quanto biofilm sono wit eterogeneih rispetto alla composizione delle specie e posizione spaziale e le condizioni fisiologiche imposti in differenti posizioni spaziali all'interno del biofilm ^6,21. In concerto con software tridimensionale di rendering e immagini software di analisi, l'architettura biofilm, relazioni spaziali tra le specie che lo compongono, e l'estensione della soppressione antimicrobica possono essere analizzati ^22-24. Tali capacità non sono possibili utilizzando standard di luce trasmessa o epifluorescenza. Successivamente, microfluidica ha raccolto un'attenzione particolare nel campo della microbiologia quanto consente lo studio di biofilm in condizioni attentamente controllate (portata, temperatura, pH, ecc) e richiede solo piccoli volumi di liquido ^25-27. Come punto di confronto, in crescita di biofilm orale nella saliva umana all'interno di un sistema modello cella di flusso (un sistema che è probabilmente considerato il modello di pilastro per molti studi biofilm orale) per 20 ore ad una simile portata e taglio conseguito,in un sistema microfluidico richiede almeno 200 ml, rispetto a 800 microlitri nel dispositivo microfluidico ^28-31. Così, un sistema modello biofilm microfluidico consente lo studio di materiale quantità limitata determinate condizioni. Infine, la tecnologia pirosequenziamento è stata ottimizzata nell'ultimo decennio richiedere solo piccole quantità di materiale di eseguire un'analisi comunità ed è sufficientemente versatile per controllare la profondità di sequenziamento per ottenere l'identità di specie biofilm anche rare. L'uso di questa tecnologia, come ad esempio batteri tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP), ha consentito di domande pertinenti riguardanti l'ecologia di biofilm da affrontare ^32,33. Queste domande imbevuti difficoltà in passato, quando pirosequenziamento non era disponibile a causa del tempo e dei costi necessari per creare librerie plasmidi e le misure tecnologiche e analitici complessi necessari per ricavare dati ^33,34. Naturalmente, un grande vantaggio di cultura indipendente apapprocci, come pirosequenziamento, è che le specie batteriche che non possono essere coltivate isolatamente entro supporti laboratorio convenzionali (specie cioè vitali ma non coltivabili) possono essere coltivate ed identificati nel sistema modello e loro abbondanza relativa nella comunità quantificati ^{35, 36} . Per aggiungere prospettiva, già nel 1963 il ritardo Sigmund Socransky stima che circa il 50% dei batteri in materiale isolato dal gengivale orale umana non potrebbe essere coltivato utilizzando condizioni di crescita di laboratorio ^37.

L'obiettivo di questo lavoro è quello di metodi descrivere l'approccio per sviluppare orale biofilm multi-specie in un sistema disponibile in commercio microfluidica (Bioflux) in: (i) condizioni rappresentative della cavità orale umana e (ii) con una composizione e abbondanza delle specie che è paragonabile alla placca sopragengivale. Inoltre, utilizzando sia software freeware e commerciali, si evidenzia come biofilm di basemisure architettura possono essere derivate da dati CLSM, con un focus sugli approcci per quantificare biofilm biomassa, rugosità, e la vitalità (basati su Live / colorazione Morto). Infine, sono descritti i passaggi necessari per raccogliere materiale biofilm per l'analisi della diversità, bTEFAP.

Protocol

Il protocollo di raccolta della saliva qui descritta è stata valutata da l'Università del Michigan Institutional Review Board per soggetto umano di ricerca. NOTA: Per quanto riguarda le recensioni istituzionali per il lavoro umano soggetti di questo tipo, le modalità e le autorizzazioni precedenti dovrebbero essere raccolto dalla istituzione ospitante. In particolare, a seconda dell'istituto, IRB o approvazione etica potrebbero aver bisogno di essere cercato e approvate prima raccolta di saliva da volo…

Representative Results

Rendering 3D di biofilm Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3. Uno strumento utile nel software Imaris è la possibilità di esaminare ogni fetta di stack biofilm raccolta e combinarli per creare ricostruzioni tridimensionali. Inoltre, gli effetti shadowing artificiali possono essere aggiunti per aiutare visivamente interpretare strutture tridimensionali. I biofilm resi possono essere orientati in qualsiasi direzione con diversi ingran…

Discussion

Questo documento mette in evidenza i metodi i passaggi di base necessari per configurare e gestire un sistema di microfluidica in modo da consentire lo sviluppo di biofilm orali multi-specie derivati ​​da pool saliva umana e coltivate in sterilizzata per filtrazione 25% pool saliva umana. Approcci per caratterizzare il biofilm sono date ma va ricordato che questi approcci descritti sono modificabili e tecnologie aggiuntive come, ad esempio, macchie o etichette possono essere introdotti. È un dato di esempio, si pot…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)