Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón
Summary
Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.
Abstract
Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.
Introduction
Rastreo de ruta anatómica es una de las herramientas más comúnmente utilizadas para descifrar la relación entre el cerebro y el comportamiento 1. El avance en las tecnologías de circuitos neuronales rastreo ha otorgado neurocientíficos con la capacidad de rastrear los circuitos neuronales de poblaciones de neuronas identificadas genéticamente en ratones 2. A pesar de estos avances técnicos que sigue siendo un reto para desentrañar la formación de circuitos neuronales especialmente durante la maduración embrionaria. Esto es porque la mayoría de los métodos de rastreo desarrolladas hasta la fecha se basan en la inyección estereotáxica de trazadores transsynaptic o virus neurotróficos modificados genéticamente (Figura 1) 2,3. Si bien estas técnicas de lograr la resolución espacial y temporal de la conectividad, varias limitaciones inherentes, tales como inyecciones de trazadores técnicamente desafiantes en el cerebro en desarrollo, la reproducibilidad de la sitio de la inyección, inflamación potencial en el sitio de la inyección y lo más importante citotoxicidad causada por los virus neurotróficos limitar su uso 4.
Un método alternativo consiste en expresar los trazadores transsynaptic como transgenes en ratones genéticamente alterados. Recientemente hemos modificado esta técnica y ha desarrollado un sistema de rastreo transsynaptic genética binaria para mapear los circuitos neurales de una población neuronal identificado genéticamente 5. Nuestra estrategia experimental se basa en dos nuevas cepas de ratón knock-in, que expresan ya sea la lectina de cebada trazador bidireccional (BL) 6 o el trazador retrógrado fragmento de la toxina tetánica C fusionado a GFP (GTT) 7 desde el locus ROSA 26 después mediada por Cre recombinación. Aquí hemos utilizado estas cepas de ratón para expresar selectivamente BL y GTT en las neuronas que producen kisspectina, un neuropéptido que está implicada en la regulación de la maduración del eje reproductivo 8,9. Se demuestra que esta técnica es adecuado para visualizar el desarrollo y maduración del besocircuitos neuronales peptina durante el desarrollo embrionario del cerebro del ratón hembra 5.
Estrategia de cría
El R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) y los R26-GFP-TTC (GTT) líneas trazadoras son ronda en cepas 5 que llevan alelos ROSA26 recombinantes. El R26-BIZ y los alelos R26-GTT son transcripcionalmente silencioso debido a la presencia de una fuerte señal de parada transcripcional, que está flanqueado por dos sitios loxP 5. Expresión del transgén BIZ GTT y se activa por la eliminación mediada por Cre de la señal de parada transcripcional. Los alelos R26 y R26-BIZ-GTT se pueden utilizar independientemente con sólo cruzar con una línea piloto Cre. Para los animales de análisis de heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados. Littermates que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, deben ser utilizados como controles. Alternativamente, también es posible generar tRiple ronda en animales portadores de los alelos Cre, R26 y R26-BIZ-GTT, sin embargo esto requerirá una cruz adicional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Expresando trazadores transsynaptic como transgenes para rastrear los circuitos neurales de poblaciones neuronales definidas genéticamente tiene varias ventajas en comparación con la inyección estereotáxica de trazadores o virus neurotopic. En primer lugar, el trazador se produce como una proteína endógena y por lo tanto no provoca ninguna respuesta inmune y una vía neural selectiva puede ser analizada en diferentes animales con alta reproducibilidad. En segundo lugar, porque este es un método no invasivo que se…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Michael Candlish for critical comments on the manuscript. This project was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft grants BO1743/6 and SFB/TRR 152 P11 and Z02 to Ulrich Boehm.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22mm x 22mm x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's Glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAG GGC |
|
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAG GTTCG |
|
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTAC ACCTGC |
|
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCT TGAA |
|
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
Riferimenti
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