Sebrafisk Keratocyte eksplantater å studere Collective Cell Migrasjon og reepithelialization i Kutan Wound Healing

Summary

Sebrafisk keratocytter migrere i celle ark fra eksplantater og gi en in vitro modell for studiet av mekanismene for kollektiv cellemigrasjon i sammenheng med epitel sårtilheling. Disse protokoller detalj en effektiv måte å etablere primære eksplantering kulturer for anvendelse i kollektive cellemigrerings analyser.

Abstract

På grunn av deres unike bevegelige egenskaper, fiske keratocytter skilt fra eksplantering kulturer har lenge vært brukt til å studere mekanismene for enkelt celle migrasjon. Men når eksplantater er etablert, disse cellene også flytte kollektivt, opprettholde mange av funksjonene som gjør enkelte keratocytter en attraktiv modell for å studere migrasjon: raske priser av bevegelighet, omfattende aktin-rik lameller med en vinkelrett aktin kabel, og relativt konstant hastighet og retning av migrasjon. I tidlige eksplantater, den raske interconversion av celler migrerer individuelt med de migrerer kollektivt gjør studiet av rollen som celle-celle adhesjon i å bestemme modus for migrasjon, og understreker de molekylære forbindelser mellom de to modusene ved migrasjon. Celler i senere explants mister sin evne til å migrere raskt og kollektivt som en epitelial til mesenchymale overgang oppstår og gener assosiert med sårtilheling og betennelse er forskjellig uttrykt. Således kan keratocyte eksplantater tjene som en in vitro modell for reepithelialization som oppstår under kutan sårheling og kan representere et unikt system for å studere mekanismene for kollektiv cellemigrering i sammenheng med et definert program av genekspresjon endringer. Et utvalg av mutante og transgene sebrafisk linjer er tilgjengelige, noe som gjør at eksplantater skal etableres fra fisk med forskjellig genetisk bakgrunn. Dette gjør det mulig rolle forskjellige proteiner i disse prosessene kan bli entydig adressert. De protokoller som er beskrevet her beskriver en enkel og effektiv metode for å etablere disse eksplantering kulturer for anvendelse i en rekke analyser knyttet til kollektiv cellemigrering.

Introduction

Studier av cellemotilitet har tradisjonelt fokusert på individuelt trekkende celler. Keratocytter dyrkede fra fisk og amfibier eksplantater har vist seg å være en kraftig modellsystem for å studere mekanismene til celle motilitet ved anvendelse av både eksperimentelt og matematisk modellering nærmer seg ^1-6. Eksperimentelt arbeid med individuelt migrerende celler blir hjulpet av den raske, glatt glidebevegelse av cellene, og samtidig opprettholde en ensartet form, hastighet og retning. Imidlertid in vivo, celler ofte bevege seg sammen under opprettholdelse av celle-celle kryss, spesielt under embryogenese, sårheling, og metastase. Således er kollektivt cellemigrering en voksende og stadig mer fremtredende område for forskning innen cellemigrering. Den kollektive migrasjon av disse cellene har nylig blitt beskrevet ⁷ og det har mange unike funksjoner som gjør det til et kraftig system for å studere kollektiv celle migrasjon i en sårtilheling modell.

ove_content "> Når skalaer er plukket fra en bedøvet voksne sebrafisk, forblir en viss epitelvev er festet til undersiden av skalaen. Når cellekulturmedium ble tilsatt, disse epitelceller, eller keratocytter, migrerer hurtig som en samlet enhet fra skalaen. Den explant kultur kan bli sett på som en epitelial sårheling modellen, der cellene migrerer bort fra eksplantatet som de ville over provisoriske matriks av en sårflaten å reetablere et intakt epitel. Nyere data tyder på at denne ex vivo dyrkningsetterligner mange funksjoner i in vivo sårtilheling i voksen sebrafisk. lukking av sår priser ^åtte oversette til en migrasjon hastighet lik den som ble observert i ex vivo system ^7. I tillegg, i en in vivo sårheling modell, behandling med warfarin tyder på at hemostase har ingen effekt på hastighet av healing, betyr samtidig behandling med hydrokortison for å redusere immunrespons ikke forsinke reepithelialization ⁸ </sup>. Som sebrafisk ikke blør når skalaen er fjernet fra dyret, er hemostase ikke et stort spiller. Selv om vi har funnet immunceller i eksplantater, har vi ikke studert effekten de kan ha på kollektiv celle migrasjon.

Protokollen presenteres her beskriver hvordan å etablere sebrafisk keratocyte eksplantering kulturer som sikrer konsistens og reproduserbarhet for bruk i mange biologiske analyser. Disse eksplantering kulturer er en spesielt overbevisende in vitro modell for kollektiv cellemigrering av flere grunner. Først, sebrafisk keratocytter er primære celler brukes innen timer etablere eksplantering kulturer. Derfor har disse cellene ikke gjennomgått de morfologiske og genekspresjon endringer knyttet til passering av primære celler ^9-13. Sekund, representerer dette systemet en modell for studiet av reepithelialization i respons til såret ^14, og, som en del av responsen til såret, en epitelial til mesenchymale transition (EMT) er igangsatt prosess som gjenspeiles av endringer i genuttrykk og cytoskeletal rearrangements ^14,15. Således har bakgrunns endringer i genekspresjon og motilitet som forekommer i ubehandlede celler blitt karakterisert, og tilveiebringe en forbindelse til å tolke endringer med behandling. Videre fisken keratocyte og den menneskelige keratinocyte er funksjonelt tilsvarende; begge er de primære epitelceller for sine respektive arter og spille en nøkkelrolle i epitel sårtilheling. Tredje, voksen sebrafisk er å få anerkjennelse som et modellsystem for en rekke menneskelige sykdommer ^16-18 inkludert melanom og andre kreftformer ^19-21, kutan sårheling ^8,14 og vev gjenfødelse ^22-24.

Tekniske fordelene ved dette modellsystemet er like overbevisende. Et økende antall mutante og transgene linjer er tilgjengelige fra non-profit, sentraliserte anlegg. Spesifikt, Sebrafisk Mutation Project (ZMP) Ved Wellcome Trust Sanger Institute har som mål å skape en knockout allel i hver proteinkodende gen i sebrafisk genom. For tiden har de muterte gener 11892, omtrent 45% av genomet, med 24088-alleler karakterisert. I tillegg aksepterer ZMP forslag og vil generere knock-outs gratis. Nye metoder i genet knockdown i larve og voksen sebrafisk ^25-28 gir fleksibilitet til å studere funksjonen til utviklingshemmede viktige gener som transgene tilnærminger er problematisk eller upraktisk.

På grunn av sine ekstremt raske utbredelsen av bevegelighet av ~ 145 mikrometer / t kort tid etter etablering av kulturer ^29, kan analyser være ferdig raskt (vanligvis i 24 timer eller mindre). Som forsøk kan gjennomføres hurtig og kulturer vokser godt ved RT, flere av de tekniske hindringer i forbindelse med pattedyrcelle migrering analyser som involverer videomikros unngås. I tillegg, i en alder av stramme forskningsbudsjetter, zebrafish er enkelt og billig vedlikeholdes.

Strukturen og virkemåten av eksplantatet er kompleks. Ettersom fisken ikke blør når skalaen er fjernet, er det usannsynlig at mer enn den overfladiske epidermale lag fjernes med skalaen. Keratocytter synes å være den dominerende celletype i eksplantatet når skalaer blir først fjernet fra fisken som de aller fleste av cellene synes å farge med et anti-E-cadherin antistoff ^14. Videre er det ingen bevis for fibroblaster i den opprinnelige kulturen som bedømmes av fravær av vimentin farging av immunfluorescens ^14. Men med gjentatt skala fjerning, synes det å være mange nøytrofile i eksplantatet (se video 1). Vi har identifisert disse cellene som neutrofiler basert på morfologiske observasjoner av deres størrelse, hurtig motilitet, og deres migrering ut av cellen arket når de utsettes for LPS (data ikke vist). I tillegg er disse cellene flekken brightly viddh et antistoff til nøytrofile cytosoliske faktor, samt med en rekke sekundære IgG-antistoffer, noe som indikerer at de har rikelig FCR på sin overflate (data ikke vist). Flere cellelag er til stede i eksplantatet. Konfokal mikroskopi avslører tilstedeværelse av et enkelt lag i nærheten av den fremre kanten til mer enn to lag av keratocytter nærheten av skalaen med nøytrofiler synlige over, under og mellom de celle keratocyte ark.

Ved tidlige tidspunkter, celler på kanten av det flerlags explant polarisere, initiere kollektiv migrering av keratocytter fra eksplantatet ved innledende forekomst av ~ 145 um / time. Området som dekkes av eksplantatet øker raskt, noe som fører til celle spredning, spenningen i arket, og en redusert hastighet på forhånd av den fremre kant. Rapid omdannelser mellom leder- og følgecellene er observert ved den ledende kant under dannelsen og lukking av spontant dannede hull i arket ^7. EttersomEMT prosessen startet med eksplantatet fortsetter, plate fragmenter og keratocytter mister sin spesialiserte, rask motilitet. Genekspresjon og morfologiske endringer i samsvar med EMT, sårheling, og inflammatoriske responser skje innen 7 dager etter kultur med eksplantater vurderes levedyktig i ca 10 dager ^14.

Protocol

Denne protokollen er i samsvar med AVMA Dyrevelferd Prinsipper for omsorg og bruk av forsøksdyr, og har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Midwestern University. 1. Utarbeidelse av anestesi, Utstyr, & Media Deklorere ca 1,5 liter vann fra springen ved hjelp av enten en kommersiell dechlorinating middel (tilgjengelig på dyrebutikker) eller ved å la vann stå i 24 timer. Få tre en L kanner og fylle hver med 500 ml deklorerte vann. Merke…

Representative Results

Som illustrert i figur 1, kan observeres migrerer ut fra under omfanget i løpet av timer for å etablere et utenforliggende kultur ark av keratocytter. Noen ganger kan en individuelt migrere keratocyte som har brutt ut av den kollektivt migrere ark holdes. I tillegg, som eksplantatet ble etablert fra en fisk som tidligere var blitt revet av, er det rikelig nøytrofiler som migrerer gjennom arket. På lengre kultur perioder, de keratocyte ark fragmenter som celler gjennomgå EMT 14. <p cl…

Discussion

Den mest kritiske trinnet for suksess for keratocyte explant kulturen er slik at skalaen til å følge dyrkningsskålen for ca 2 – 3 minutter før tilsetting av kulturmediet. Omtrent 75% av skalaer vil feste seg og vokse planter (antall kulturer etablert for hvert eksperiment vil måtte justeres tilsvarende). Keratocyte ark ikke dannes rundt hver skala fjernet fra fisken og plassert i kultur av flere grunner. Først DAPI farging av eksplantater viser at noen vekter har få cellene festet, og dermed er det forventet at d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.