الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية
Summary
keratocytes الزرد الهجرة في أوراق خلية من إإكسبلنتس وتقديم نموذج في المختبر لدراسة آليات الهجرة الخلية الجماعية في سياق الظهارية التئام الجروح. هذه البروتوكولات بالتفصيل وسيلة فعالة لإقامة الثقافات يزدرع الأولية لاستخدامها في المقايسات الهجرة الجماعية الخلية.
Abstract
نظرا لخصائص متحركة فريدة من نوعها، فصل keratocytes الأسماك من منذ فترة طويلة تستخدم الثقافات يزدرع لدراسة آليات الهجرة خلية واحدة. ومع ذلك، عندما يتم تأسيس إإكسبلنتس، وهذه الخلايا أيضا تتحرك بشكل جماعي، والحفاظ على العديد من الميزات التي تجعل الفرد keratocytes نموذجا جذابا لدراسة الهجرة: سرعة معدلات الحركة، واسعة النطاق، الأكتين الغنية صفاحات مع كابل الأكتين عمودي، وبسرعة ثابتة نسبيا و اتجاه الهجرة. في إإكسبلنتس وقت مبكر، وinterconversion السريع لخلايا المهاجرة بشكل فردي مع أولئك الذين يهاجرون جماعيا يسمح دراسة دور التصاقات خلية خلية في تحديد النمط من الهجرة، وتشدد على الروابط الجزيئية بين وضعي للهجرة. الخلايا في إإكسبلنتس في وقت لاحق تفقد قدرتها على الهجرة بسرعة وبشكل جماعي باعتباره الظهارية لالوسيطة الانتقال يحدث ويتم التعبير عن الجينات المرتبطة التئام الجروح والتهاب تفاضلي. وهكذا، يمكن إإكسبلنتس خلية قرنية بمثابة نموذج في المختبر لعودة التظهرن الذي يحدث أثناء الجلدي التئام الجروح ويمكن أن تمثل نظاما فريدا لدراسة آليات الهجرة الخلية الجماعية في سياق برنامج محدد للتغيرات التعبير الجيني. هي مجموعة متنوعة من خطوط الزرد متحولة والمعدلة وراثيا المتاحة، والتي تسمح إإكسبلنتس التي ستنشأ من السمك مع خلفيات وراثية مختلفة. وهذا يسمح للدور البروتينات المختلفة داخل هذه العمليات التي ينبغي معالجتها بشكل فريد. البروتوكولات المذكورة هنا تصف طريقة سهلة وفعالة لإقامة هذه الثقافات يزدرع لاستخدامها في مجموعة متنوعة من المقايسات المتعلقة بالهجرة خلية الجماعية.
Introduction
وقد ركزت دراسات الحركة خلية تقليديا على الخلايا المهاجرة بشكل فردي. وقد أثبتت Keratocytes مثقف من الأسماك والبرمائيات إإكسبلنتس أن يكون نظام نموذج قوي لدراسة آليات حركية الخلية باستخدام النمذجة كلا التجريبية والرياضية تقترب 1-6. وساعد العمل التجريبي على الخلايا المهاجرة بشكل فردي عن طريق السريع، وسلاسة الحركة مزلق من الخلايا، مع الحفاظ على شكل موحد، والسرعة، والاتجاه. ومع ذلك، في الجسم الحي، والخلايا في كثير من الأحيان تتحرك بشكل جماعي مع الحفاظ على تقاطعات خلية خلية، وخاصة خلال مرحلة التطور الجنيني، التئام الجروح، والانبثاث. وهكذا، الهجرة الخلية الجماعية هي منطقة النمو وبارزة على نحو متزايد من البحوث في مجال الهجرة الخلية. وقد تم مؤخرا وصف الهجرة الجماعية من هذه الخلايا 7 ولها العديد من المزايا الفريدة التي تجعل من نظام قوي لدراسة الهجرة الخلية الجماعية في نموذج التئام الجروح.
ove_content "> وعندما التقطه جداول من الزرد الكبار تخدير، لا تزال بعض الأنسجة الظهارية التي تعلق على الجانب السفلي من الجدول. عند إضافة مستنبت الخلية، وهذه الخلايا الظهارية، أو keratocytes، تهاجر بسرعة كوحدة جماعية من الحجم الكبير. و يمكن الاطلاع على ثقافة يزدرع باعتبارها الظهارية الجرح نموذج الشفاء، حيث تقوم الخلايا تهاجر بعيدا عن يزدرع كما يفعلون عبر مصفوفة المؤقت جرح سرير لإعادة تأسيس ظهارة سليمة. وتشير البيانات الحديثة إلى أن هذا خارج الحي يقلد الثقافة العديد من الميزات لل في الجسم الحي التئام الجروح في الزرد الكبار. معدلات إغلاق الجرح 8 تترجم إلى سرعة هجرة مماثلة لتلك التي لوحظت في فيفو السابقين نظام 7. وبالإضافة إلى ذلك، في جرح في الجسم الحي الشفاء نموذج، والمعاملة مع الوارفارين تشير إلى أن الإرقاء ليس له تأثير على معدل للشفاء، بينما العلاج مع الهيدروكورتيزون لتقليل استجابة مناعية لا يؤخر عودة التظهرن 8 </سوب>. كما لا تنزف الزرد عند إزالة نطاق من الحيوان، الارقاء ليست لاعبا رئيسيا. على الرغم من أننا قد وجدت خلايا المناعة في إإكسبلنتس، ونحن لم درست الآثار التي قد تترتب على الهجرة الخلية الجماعية.يصف بروتوكول المعروضة هنا كيفية تأسيس الزرد الثقافات خلية قرنية يزدرع أن ضمان الاتساق واستنساخ للاستخدام في العديد من المقايسات البيولوجية. هذه الثقافات يزدرع هي مقنعة خاصة في نموذج المختبر للهجرة الخلايا الجماعية لعدة أسباب. أولا، keratocytes الزرد هي الخلايا الأولية المستخدمة في غضون ساعات من إقامة الثقافات يزدرع. ولذلك، فإن هذه الخلايا لا خضعت لتغيرات مورفولوجية والتعبير الجيني المرتبط مرور الخلايا الأولية 9-13. ثانيا، هذا النظام يمثل نموذجا لدراسة عودة التظهرن ردا على إصابة 14، وكجزء من الاستجابة للإصابة، وهو الظهارية لالوسيطة TRيبدأ ansition (EMT) عملية كما يتضح من التغيرات في التعبير الجيني وإعادة ترتيب هيكل الخلية 14،15. وهكذا، تم التعرف على التغييرات خلفية في التعبير الجيني والحركة التي تحدث في الخلايا غير المعالجة وتوفير إطار لتفسير التغييرات مع العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن خلية قرنية الأسماك والقرنية البشرية وتعادل وظيفيا. على حد سواء هي الخلايا الظهارية الأولية من الأنواع الخاصة بكل منها ولعب دورا رئيسيا في الظهارية التئام الجروح. الثالث، الزرد الكبار تكتسب الاعتراف كنظام نموذج لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان 16-18 بما في ذلك سرطان الجلد وغيرها من أنواع السرطان 19-21، الجرح الجلدي الشفاء 8،14 والأنسجة تجديد 22-24.
المزايا الفنية لهذا النظام النموذجي هي مقنعة على حد سواء. وتتوفر من غير الهادفة للربح، ومرافق مركزية وهناك عدد متزايد من خطوط متحولة والمعدلة وراثيا. على وجه التحديد، ومشروع الطفرة اسماك الزرد (ZMP) في معهد ويلكوم ترست سانجر يهدف إلى إنشاء أليل خروج المغلوب في كل بروتين الترميز الجينات في الجينوم الزرد. حاليا، فقد تحور الجينات 11892، ما يقرب من 45٪ من الجينوم، مع 24088 الأليلات يتميز. وبالإضافة إلى ذلك، ZMP تقبل المقترحات وسوف تولد تدق الرافضة مجانا. الطرق الحديثة في ضربة قاضية الجينات في اليرقات والكبار الزرد 25-28 توفر المرونة اللازمة لدراسة وظيفة الجينات الهامة تنمويا التي النهج المعدلة وراثيا هي إشكالية أو غير عملية.
بسبب بمعدلات سريعة للغاية على من الحركة من ~ 145 ميكرون / ساعة بعد وقت قصير من إنشاء الثقافات 29، فحوصات يمكن أن تكتمل بسرعة (عادة في 24 ساعة أو أقل). كما التجارب يمكن أن تكتمل بسرعة والثقافات تنمو بشكل جيد في RT، العديد من العقبات التقنية المرتبطة يتم تجنب المقايسات الثدييات الهجرة الخلية التي تنطوي المجهري الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، في سن تشديد ميزانيات البحوث، zebrafوبسهولة وبتكلفة زهيدة الحفاظ على العش.
هيكل وسلوك يزدرع معقد. وبما أن الأسماك لا تنزف عند إزالة النطاق، وأنه من غير المرجح أن أكثر بكثير من طبقات البشرة السطحية وإزالتها مع الحجم. تظهر Keratocytes أن يكون نوع من الخلايا السائد في يزدرع عندما تتم إزالة المقاييس في البداية من الأسماك كما تظهر الغالبية العظمى من الخلايا لوصمة عار مع الأجسام المضادة لمكافحة E-كادهيرين 14. وعلاوة على ذلك، ليس هناك أي دليل من الخلايا الليفية في ثقافة الأولية كما تقرره غياب فيمنتين تلطيخ المناعي 14. ومع ذلك، مع إزالة القشور المتكررة، يبدو أن هناك العديد من العدلات في النباتى (انظر فيديو 1). لقد حددنا هذه الخلايا كما العدلات بناء على الملاحظات الشكلية من حجمها، بسرعة الحركة، وهجرتهم من ورقة خلية عندما تتعرض لLPS (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، هذه الخلايا وصمة عار الطرافة الزاهيةح أجسام مضادة لعامل عصاري خلوي العدلات وكذلك مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة مفتش الثانوية، مما يدل على أن لديهم FcRs وفيرة على سطحها (لا تظهر البيانات). طبقات خلايا متعددة موجودة ضمن النباتى. المجهر متحد البؤر يكشف وجود طبقة واحدة بالقرب من الحافة الأمامية لأكثر من طبقتين من keratocytes بالقرب من النطاق مع العدلات مرئية فوق، تحت، وبين الأوراق خلية قرنية الخلية.
في نقاط زمنية مبكرة، الخلايا على حافة متعدد الطبقات يزدرع استقطاب، وبدء الهجرة الجماعية للkeratocytes من يزدرع بأسعار الأولى من ~ 145 ميكرون / ساعة. المنطقة التي تغطيها يزدرع يزيد بسرعة، مما يؤدي إلى خلية نشر والتوتر داخل ورقة، وانخفاض معدل مسبقا من الحافة الأمامية. ويلاحظ interconversions السريع بين الخلايا القائد والتابعين على حافة الرائدة خلال تشكيل وإغلاق الثقوب تشكلت عفويا خلال ورقة 7. وبما أنوتستمر عملية EMT بدأت مع يزدرع، شظايا ورقة وتفقد keratocytes المتخصصة، والقدرة على الحركة السريعة لها. التعبير الجيني والتغيرات المورفولوجية تتفق مع EMT، التئام الجروح، والاستجابات الالتهابية تحدث خلال 7 أيام من الثقافة مع إإكسبلنتس التي يجري النظر فيها قابلة للحياة لنحو 10 أيام 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية لنجاح ثقافة خلية قرنية النباتى هو السماح للنطاق التمسك الطبق الثقافة لحوالي 2-3 دقائق قبل إضافة مستنبت. ما يقرب من 75٪ من المقاييس ستلتزم وتنمو ورقة (وعدد من الثقافات التي أنشئت لكل تجربة تحتاج إلى تعديل وفقا لذلك). أوراق خلية قرنية لا تشكل حول كل نطا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من جانب صناديق من الغرب الأوسط الكلية الجامعية للعلوم الصحة منح البحوث تسهيل منح لEEH ومكتب جامعة الغرب الأوسط للبحوث والبرامج التي ترعاها منحت جماعية غرانت إلى KJL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
Riferimenti
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture – primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
