Zebrafisk Keratocyte Eksplantater at studere Kollektiv Cell Migration og reepitelisering i kutant Sårheling

Summary

Zebrafisk keratocytter migrere i celle plader fra eksplantater og give en in vitro model for studiet af mekanismerne i kollektiv celle migration i forbindelse med epitelial sårheling. Disse protokoller detalje en effektiv måde at etablere primære eksplantatkulturer til brug i kollektive celle migration assays.

Abstract

På grund af deres unikke bevægelige egenskaber, fisk keratocytter adskilles fra eksplantatkulturer længe har været anvendt til at undersøge mekanismerne for enkelt celle migration. Men når eksplantater er etableret, disse celler også flytte kollektivt, vedligeholdelse mange af de funktioner, der gør individet keratocytter en attraktiv model til at studere migration: hurtige satser af motilitet, omfattende actin-rige lameller med en vinkelret actin kabel og relativt konstant hastighed og retning af migration. I begyndelsen af ​​eksplantater, den hurtige omdannelse af celler migrerer individuelt med de migrerer kollektivt tillader studiet af den rolle, celle-celle sammenvoksninger at bestemme tilstanden af ​​migration, og understreger de molekylære forbindelser mellem de to former for migration. Celler i senere eksplantater mister deres evne til at migrere hurtigt og kollektivt som en epitelial til mesenkymale overgang forekommer, og gener, der er forbundet med sårheling og inflammation udtrykkes forskelligt. Således kan keratocyte eksplantater tjene som en in vitro model for reepitelisering, der opstår under kutan sårheling og kan repræsentere et unikt system til at studere mekanismer for kollektive cellemigrering i forbindelse med en defineret program af genekspression ændringer. En række af mutante og transgene zebrafisk linjer er tilgængelige, som giver eksplantater oprettes fra fisk med forskellige genetiske baggrunde. Dette tillader rolle af forskellige proteiner i disse processer til entydigt rettet. Protokollerne beskrevet her beskriver en nem og effektiv fremgangsmåde til etablering af disse eksplantatkulturer til anvendelse i en række assays relateret til kollektiv cellemigrering.

Introduction

Undersøgelser af cellemotilitet har traditionelt fokuseret på individuelt migrerende celler. Keratocytter dyrket fra fisk og padder eksplantater har vist sig at være et effektivt modelsystem til at studere mekanismerne i cellemotilitet hjælp af både eksperimenterende og matematisk modellering ^1-6. Eksperimentelt arbejde individuelt migrerende celler er hjulpet af den hurtige, glatte glidende bevægelse af cellerne, og samtidig opretholde en ensartet form, hastighed og retning. Men in vivo celler ofte flytte kollektivt samtidig opretholde celle-celle-kryds, især under embryogenese, sårheling og metastase. Således kollektiv celle migration er et voksende og stadig mere fremtrædende forskningsområde inden for celle migration. Den kollektive migration af disse celler er for nylig blevet beskrevet ⁷ og det har mange unikke egenskaber, som gør det et kraftfuldt system til at studere kollektivt cellemigration i sårheling model.

ove_content "> Når skalaer er plukket fra en bedøvet voksen zebrafisk, forbliver nogle epitelvæv fastgjort til undersiden af ​​skalaen. Når der tilføjes cellekulturmedium, disse epitelceller eller keratocytter, migrere hurtigt som en kollektiv enhed fra skalaen. Den eksplantation kultur kan ses som en epitelial sårheling model, hvor cellerne migrerer væk fra eksplantatet, som de ville tværs midlertidig matrix af en sårbunden at genetablere et intakt epitel. Nylige data tyder på, at denne ex vivo kultur efterligner mange funktioner i in vivo sårheling hos voksne zebrafisk. sårlukning satser ⁸ oversætte til en migration hastighed svarende til den observeret i ex vivo-systemet ^7. Endvidere i en in vivo sårheling model, behandling med warfarin antyder, at hæmostase har nogen effekt på pris for helbredelse, mens behandling med hydrocortison at mindske immunrespons ikke forsinker reepitelisering ⁸ </sup>. Da zebrafisk ikke bløder, når skalaen er fjernet fra dyret, hæmostase er ikke en vigtig aktør. Selvom vi har fundet immunceller i eksplantater, har vi ikke undersøgt de virkninger, de måtte have på kollektiv celle migration.

Protokollen præsenteres her beskriver, hvordan man etablerer zebrafisk keratocyte eksplantatkulturer der sikrer ensartethed og reproducerbarhed til brug i mange biologiske assays. Disse eksplantatkulturer er en særlig overbevisende in vitro model for kollektiv cellemigration af flere grunde. Først zebrafisk keratocytter er primære celler, der anvendes inden for timer efter oprettelse eksplantatkulturer. Derfor har disse celler ikke har undergået de morfologiske og genekspression ændringer i forbindelse med passage af primærelementer ^9-13. For det andet udgør denne ordning en model for studiet af reepitelisering som reaktion på såret ¹⁴ og som en del af svaret på såret, en epitelial til mesenkymale transition (EMT) proces initieres som vist ved ændringer i genekspression og cytoskeletale omlejringer ^14,15. Således har baggrunden ændringer i genekspression og motilitet, som forekommer i ubehandlede celler er blevet karakteriseret, og giver en forbindelse til at fortolke ændringer med behandling. Endvidere fisk keratocyte og den humane keratinocyt er funktionelt ækvivalente; begge er de primære epitelceller fra deres respektive arter og spiller en central rolle i epitel sårheling. Tredje voksen zebrafisk vinder anerkendelse som et modelsystem til en række humane sygdomme ^16-18 herunder melanom og andre cancere ^19-21, kutan sårheling ^8,14 og vævsregenerering ^22-24.

Tekniske fordele ved dette modelsystem er lige overbevisende. Et stigende antal mutante og transgene linjer er tilgængelige fra non-profit, centraliserede anlæg. Specifikt zebrafisk Mutation Project (ZMP) På Wellcome Trust Sanger Institute har til formål at skabe en knockout allel i hvert proteinkodende gen i zebrafisk genom. I øjeblikket har de muterede 11.892 gener, ca. 45% af genomet, med 24.088 alleler karakteriseret. Desuden ZMP accepterer forslag, og vil generere gratis knock-outs. Nylige metoder i gen knockdown i larver og voksne zebrafisk ^25-28 giver fleksibilitet til at studere funktionen af udviklingsmæssigt vigtige gener for hvilke transgene metoder er problematiske eller upraktisk.

På grund af deres ekstremt hurtige satser for motilitet ~ 145 um / time kort efter etablering af kulturer ^29, kan analyser afsluttes hurtigt (normalt i 24 timer eller mindre). Som forsøg kan gennemføres hurtigt og kulturer vokser godt ved stuetemperatur, flere af de tekniske forhindringer, der er forbundet med mammale celle migration assays involverer video mikroskopi undgås. Desuden i en alder af stramme forskningsbudgetter, zebrafish er nemt og billigt vedligeholdt.

Strukturen og adfærd eksplantatet er kompleks. Da fisken ikke bløder, når skalaen er fjernet, er det usandsynligt, at meget mere end de overfladiske epidermale lag fjernes med skalaen. Keratocytter synes at være den dominerende celletype i eksplantatet når skalaer indledningsvis fjernes fra fisk som størstedelen af cellerne synes at pletten med et anti-E-cadherin antistof ^14. Endvidere er der ingen tegn på fibroblaster i den oprindelige kultur, bedømt ved fraværet af vimentin farvning ved immunofluorescens ^14. Men med fjernelse gentagen skala, synes der at være mange neutrofiler i eksplantatet (se Video 1). Vi har identificeret disse celler som neutrofiler baseret på morfologiske observationer af deres størrelse, hurtigt motilitet, og deres vandring ud af cellen arket, når de udsættes for LPS (data ikke vist). Derudover disse celler farves lyst with et antistof mod neutrofil cytosol faktor såvel som med en række sekundære IgG-antistoffer, hvilket indikerer, at de har rigelige FcR'er på deres overflade (data ikke vist). Flere cellelag er til stede i eksplantatet. Konfokal mikroskopi afslører tilstedeværelsen af ​​et enkelt lag nær forkanten til mere end to lag keratocytter nær skala med neutrofiler synlige over, under og mellem celle keratocyte ark.

Ved tidlige tidspunkter, celler på kanten af ​​flere lag explant polarisere, indlede kollektive migration af keratocytter fra eksplantatet ved indledende satser ~ 145 um / time. Det område, som eksplantatet stiger hurtigt, hvilket fører til celle spredning, spænding i pladen, og en nedsat hastighed af forud for forkanten. Hurtige interomdannelser mellem leder og follower celler observeres på forkant under dannelsen og lukning af spontant dannede huller i arket ^7. SomEMT indledt med eksplantatet fortsætter arket fragmenter og de keratocytter mister deres specialiserede, hurtige motilitet. Genekspression og morfologiske ændringer i overensstemmelse med EMT, sårheling, og inflammatoriske reaktioner forekommer inden for 7 dages dyrkning med eksplantater overvejes rentabelt for ca. 10 dage ^14.

Protocol

Denne protokol er i overensstemmelse med AVMA dyrevelfærdsprincipper for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Midwestern University. 1. Fremstilling af anæstesi, Udstyr, og medier Dechlorinate ca. 1,5 L postevand ved hjælp af enten et kommercielt dechlorinating agent (findes på dyrehandlere) eller ved at lade vand stå i 24 timer. Opnå tre 1 L bægerglas og fylde hver med 500 ml dechlorerede vand. M…

Representative Results

Som illustreret i figur 1, kan ark keratocytter observeres migrere ud fra under skala i timer oprettelse eksplantatet kultur. Indimellem kan en individuelt migrerende keratocyte der har brudt væk fra kollektivt migrere ark overholdes. Desuden, som eksplantatet blev etableret fra en fisk, der tidligere var blevet plukket, der er rigelige neutrofiler, der migrerer gennem arket. På længere kultur perioder de keratocyte ark fragmenter som celler undergår EMT 14. D…

Discussion

Det mest kritiske skridt for succes keratocyte eksplantation kultur tillader skalaen til at holde sig til kultur skål for ca. 2 – 3 min før tilsætning af dyrkningsmediet. Ca. 75% af skalaer vil klæbe og vokse ark (antallet af kulturer, der er etableret for hvert forsøg skal justeres i overensstemmelse hermed). Keratocyte ark ikke danner omkring hver skala fjernes fra fisken og anbragt i kultur i flere grunde. Først DAPI farvning af eksplantater viser, at visse skalaer har få celler fæstnet, og dermed forventes d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.