Poisson zèbre kératocyte explants d'étudier la migration cellulaire collective et réépithélialisation dans la cicatrisation cutanée plaies

Summary

Kératocytes poisson zèbre migrent en feuilles de cellules à partir d'explants et fournissent un modèle in vitro pour l'étude des mécanismes de la migration cellulaire collective dans le contexte de la guérison de la plaie épithéliale. Ces protocoles détail un moyen efficace de mettre en place des cultures d'explants primaires pour une utilisation dans des essais collectifs de migration cellulaire.

Abstract

En raison de leurs propriétés uniques mobiles, kératocytes de poissons dissociées des cultures d'explants ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes de la migration d'une cellule unique. Toutefois, lorsque explants sont établis, ces cellules se déplacent également collectivement, le maintien de nombreuses fonctionnalités qui rendent individuelle kératocytes un modèle attrayant pour étudier la migration: les taux rapides de la motilité, vaste lamelles d'actine riche avec un câble d'actine perpendiculaire, et la vitesse relativement constante et direction de la migration. Au début des explants, l'interconversion rapide des cellules qui migrent individuellement avec ceux qui émigrent collectivement permet l'étude du rôle des adhérences cellule-cellule pour déterminer le mode de la migration, et souligne les liens moléculaires entre les deux modes de migration. Les cellules dans les explants ultérieures perdent leur capacité à migrer rapidement et collectivement en tant que transition épithélio-mésenchymateuse se produit et les gènes associés à la guérison de la plaie et l'inflammation sont exprimés différentiellement. Ainsi, kératocytes explants peuvent servir comme un modèle in vitro pour la réépithélialisation qui se produit lors de la cicatrisation des plaies cutanées et peuvent représenter un système unique d'étudier les mécanismes de la migration cellulaire collective dans le cadre d'un programme défini de changements dans l'expression génique. Une variété de lignes de poisson zèbre mutantes et transgéniques sont disponibles, ce qui permet explants à établir à partir de poissons avec différents fonds génétiques. Ceci permet le rôle des protéines différentes à l'intérieur de ces processus à traiter de manière unique. Les protocoles décrits ici décrivent une méthode simple et efficace pour l'établissement de ces cultures d'explants pour une utilisation dans une variété d'essais liés à la migration cellulaire collective.

Introduction

Les études de motilité cellulaire sont traditionnellement concentrées sur cellules en migration individuellement. Kératinocytes cultivées à partir de poissons et d'amphibiens explants se sont révélés être un système modèle puissant pour étudier les mécanismes de la motilité cellulaire utilisant la modélisation expérimentale et mathématique approches ^1-6. Les travaux expérimentaux sur les cellules migrent individuellement est aidée par le mouvement de glisse rapide, lisse des cellules, tout en maintenant un uniforme forme, la vitesse, et la direction. Cependant, in vivo, les cellules se déplacent collectivement fréquemment, tout en maintenant les jonctions cellule-cellule, en particulier au cours de l'embryogenèse, la cicatrisation des plaies, et les métastases. Ainsi, la migration cellulaire collective est une zone de croissance et de plus en plus important de la recherche dans le domaine de la migration cellulaire. La migration collective de ces cellules a été récemment décrit ⁷ et il a de nombreuses caractéristiques uniques qui en font un système puissant pour étudier la migration cellulaire collective dans un modèle de cicatrisation.

ove_content "> Lorsque échelles sont cueillies à partir d'un poisson zèbre adulte anesthésié, certains tissu épithélial reste attaché à la face inférieure de l'échelle. Lorsque milieu de culture cellulaire est ajouté, ces cellules épithéliales, ou kératinocytes, migrent rapidement une unité collective de l'échelle. La culture d'expiant peut être considérée comme un modèle de cicatrisation de l'épithélium de la plaie, dans lequel les cellules migrent loin de l'explant comme ils le feraient à travers la matrice provisoire d'un lit de la plaie pour rétablir un epithelium intact. Des données récentes suggèrent que cette ex vivo imite de culture de nombreuses caractéristiques de in vivo la cicatrisation chez le poisson zèbre adulte. Les taux de fermeture de plaies ⁸ traduisent par une vitesse de migration similaire à celle observée dans l'ex vivo système ^7. En outre, dans une plaie modèle in vivo de guérison, le traitement par warfarine suggère que l'hémostase n'a aucun effet sur ​​le taux de guérison, tandis que le traitement par hydrocortisone pour diminuer la réponse immunitaire ne tardez pas réépithélialisation ⁸ </sup>. Comme le poisson zèbre ne saigne pas lorsque l'échelle est retiré de l'animal, l'hémostase ne est pas un acteur majeur. Bien que nous avons trouvé des cellules immunitaires dans les explants, nous ne avons pas étudié les effets qu'ils pourraient avoir sur la migration cellulaire collective.

Le protocole présenté ici décrit comment établir cultures kératocyte d'explants de poisson zèbre qui assurent la cohérence et la reproductibilité pour une utilisation dans de nombreux dosages biologiques. Ces cultures d'explants sont particulièrement convaincante modèle in vitro pour la migration cellulaire collective pour plusieurs raisons. Tout d'abord, les kératinocytes de poisson zèbre sont des cellules primaires utilisées dans les heures d'établir cultures d'explants. Par conséquent, ces cellules ne ont pas subi les changements morphologiques et génétiques expression associée à passage de cellules primaires ^9-13. D'autre part, ce système constitue un modèle pour l'étude de réépithélialisation en réponse à blessant ¹⁴ et, dans le cadre de la réponse à une blessure, un épithéliale mésenchymateuses à transition (EMT) processus est lancé comme en témoignent les changements dans l'expression des gènes et des réarrangements du cytosquelette ^14,15. Ainsi, les modifications de fond de l'expression génique et la motilité qui se produisent dans les cellules non traitées ont été caractérisés et fournir un contexte pour interpréter les changements avec le traitement. En outre, le kératocytes du poisson et le kératinocyte humain sont fonctionnellement équivalents; les deux sont des cellules épithéliales primaires de leurs espèces respectives et jouent un rôle clé dans la cicatrisation epitheliale. Troisièmement, le poisson zèbre adulte sont plus en plus reconnue comme un système modèle pour une variété de maladies humaines ^16-18 y compris le mélanome et d'autres cancers ^19-21, plaies cutanées guérison ^8,14 et la régénération des tissus ^22-24.

Les avantages techniques de ce système de modèle sont tout aussi convaincants. Un nombre croissant de lignées mutantes et transgéniques sont disponibles auprès but non lucratif, des installations centralisées. Plus précisément, le projet Mutation poisson zèbre (ZMP) Au Wellcome Trust Sanger Institute vise à créer un allèle de KO dans chaque codant pour la protéine gène dans le génome du poisson zèbre. Actuellement, ils ont muté 11.892 gènes, environ 45% du génome, avec 24 088 alleles caractérisés. En outre, ZMP accepte les propositions et générera gratuitement knock-out. Des méthodes récentes de knockdown de gènes dans des larves et des adultes poisson zèbre ^25-28 offrent une flexibilité pour étudier la fonction des gènes importants pour le développement pour lesquels des approches transgéniques sont problématiques ou impraticable.

En raison de leurs taux extrêmement rapides de la motilité de ~ 145 um / h peu après l'établissement de cultures ^29, les essais peuvent être achevées rapidement (généralement en 24 heures ou moins). Comme les expériences peuvent être achevées rapidement et les cultures poussent bien à la température ambiante, plusieurs des obstacles techniques associés à des mammifères essais de migration cellulaire impliquant la microscopie vidéo sont évités. En outre, à l'ère de resserrement des budgets de recherche, zebrafish sont facilement et économiquement maintenue.

La structure et le comportement de l'explant est complexe. Comme les poissons ne saignent pas lorsque l'échelle est supprimé, il est peu probable que beaucoup plus que les couches superficielles de l'épiderme sont retirés avec l'échelle. Kératocytes semblent être le type cellulaire prédominant dans l'expiant lorsque les échelles sont d'abord retirés du poisson comme la grande majorité des cellules apparaissent pour colorer avec un anticorps anti-E-cadhérine ^14. En outre, il ne existe aucune preuve de fibroblastes dans la culture initiale en juger par l'absence de coloration par immunofluorescence de la vimentine ^14. Cependant, avec suppression répétée à grande échelle, il semble y avoir de nombreux neutrophiles dans l'expiant (voir vidéo 1). Nous avons déterminé que ces cellules neutrophiles à partir d'observations morphologiques de leur taille, la motilité rapidement, et leur migration hors de la feuille de cellules quand ils sont exposés au LPS (données non présentées). En outre, ces cellules se colorent brillamment l'esprith un anticorps au facteur cytosolique des neutrophiles ainsi que d'une variété d'anticorps IgG secondaires, ce qui indique qu'ils ont FcR abondants sur leur surface (données non présentées). Plusieurs couches de cellules sont présentes dans l'expiant. La microscopie confocale révèle la présence d'une seule couche à proximité du bord d'attaque de plus de deux couches de kératinocytes à proximité de l'échelle avec les neutrophiles visibles ci-dessus, en dessous et entre les feuilles de kératocytes cellulaire.

Aux points de temps précoces, les cellules sur le bord de la multi-couche explant polariser, initiant la migration collective des kératinocytes de l'explant à des taux initiaux de ~ 145 um / h. La zone couverte par l'explant augmente rapidement, ce qui conduit à la propagation cellulaire, la tension à l'intérieur de la feuille, et une diminution du taux de l'avance du bord d'attaque. Interconversions rapides entre les cellules de leader et suiveur sont observés à la pointe lors de la formation et de la fermeture de trous formés spontanément au sein de la feuille ^7. Comme leEMT processus initié avec l'expiant continue, les fragments de feuilles et les kératinocytes perdent leur spécialisé, la motilité rapide. L'expression des gènes et des changements morphologiques compatibles avec EMT, la cicatrisation des plaies, et les réponses inflammatoires se produisent dans les 7 jours de culture avec des explants étant considérées comme viables pendant environ 10 jours ^14.

Protocol

Ce protocole est conforme aux principes de bien-être des animaux AVMA pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Midwest. 1. Préparation d'anesthésie, équipement, et médias Déchlorer environ 1,5 L d'eau du robinet en utilisant soit un agent commercial de déchloration (disponible dans les magasins pour animaux de compagni…

Representative Results

Comme illustré sur la figure 1, des feuilles de kératinocytes peuvent être observées migration de dessous de l'échelle dans les heures suivant l'établissement de la culture de l'explant. Occasionnellement, une kératocyte migration individuelle qui se est détaché de la feuille migration collectivement peut être observée. En outre, dans l'expiant a été établie à partir d'un poisson qui a été préalablement pincées, il existe abondantes neutrophiles migrent à travers …

Discussion

L'étape la plus critique pour le succès de la culture d'expiant kératocyte permet à l'échelle d'adhérer à la boîte de culture pendant environ 2-3 min avant l'addition du milieu de culture. Environ 75% des échelles va adhérer et de grandir feuilles (le nombre de cultures établies pour chaque expérience devra être ajustée en conséquence). les feuilles de kératocytes ne forment pas autour de chaque échelle présente dans le poisson et mis en culture pour plusieurs raisons. Tout d'ab…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.