Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Summary

Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen.

Abstract

Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften motile dissoziierte Fisch Keratozyten aus Explantatkulturen werden seit langem verwendet, um die Mechanismen der einzelnen Zellwanderung zu untersuchen. Allerdings, wenn Explantate ansässig sind, diese Zellen zusammen bewegen sich auch, die Aufrechterhaltung viele der Funktionen, die einzelnen Keratozyten ein attraktives Modell, um die Migration zu studieren machen: schnelle Raten von Beweglichkeit, umfangreiche Aktin-reichen Lamellen mit einer senkrecht Aktin Kabel und relativ konstanter Drehzahl und Migrationsrichtung. In frühen Explantate, die rasche Umwandlung von Zellen einzeln Migration mit denen die Migration kollektiv ermöglicht die Untersuchung der Rolle der Zell-Zell-Adhäsionen bei der Bestimmung des Modus der Migration, und betont die molekularen Bindungen zwischen den beiden Betriebsarten der Migration. Zellen in späteren Explantate verlieren ihre Fähigkeit, rasch und gemeinsam wandern, wenn eine epitheliale mesenchymalen Übergang auftritt und Genen mit der Wundheilung und Entzündung verbunden sind, differentiell exprimierten. Somit kann Keratozyten Explantate als in vitro-Modell für die Reepithelialisierung die kutanen Wundheilung auftritt, und kann ein einzigartiges System zur Mechanismen kollektiver Zellmigration im Rahmen eines definierten Programms von Veränderungen der Genexpression zu studieren repräsentieren dienen. Eine Vielzahl von Mutanten und transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die Explantate von Fisch mit verschiedenen genetischen Hintergründen festgelegt werden kann. Dies ermöglicht es die Rolle von verschiedenen Proteinen innerhalb dieser Prozesse eindeutig adressiert werden. Die hier aufgeführten Protokolle beschreiben eine einfache und effektive Methode zur Festlegung dieser Explantatkulturen für den Einsatz in einer Vielzahl von Assays auf Kollektiv Zelle Migration.

Introduction

Studium der Zellbewegung traditionell auf individuell wandernden Zellen konzentriert. Keratozyten von Fischen und Amphibien Explantate kultiviert haben sich als ein leistungsfähiges Modellsystem, um die Mechanismen der Zellbeweglichkeit Studie mit experimentellen und mathematischen Modellierung nähert ^1-6 sein. Experimentelle Arbeiten auf individuell wandernden Zellen wird durch die schnelle, leichtgängige Bewegung der Zellen unterstützt, und gleichzeitig eine gleichmäßige Form, Geschwindigkeit und Richtung. In vivo werden Zellen kollektiv bewegen häufig während Zell-Zell-Junctions, insbesondere während der Embryogenese, Wundheilung und Metastase. So ist kollektive Zellmigration eine wachsende und immer wichtigere Forschungsgebiet im Bereich der Zellmigration. Die kollektive Migration dieser Zellen wurde vor kurzem beschrieben ⁷ und es hat viele einzigartige Eigenschaften, die es ein leistungsfähiges System zur kollektiven Zellmigration in einer Wundheilung Modell untersuchen zu machen.

ove_content "> Beim Schuppen werden aus einem betäubten erwachsenen Zebrafisch gezupft bleibt etwas Epithelgewebe an der Unterseite des Umfangs angebracht ist. Wenn die Zellkulturmedium zugegeben wird, diese Epithelzellen oder Keratozyten, schnell wandern als Sammeleinheit von der Skala. Das Explantatkultur kann als epitheliale Wundheilung Modell, in dem die Zellen wandern vom Explantat wie sie es in der vorläufigen Matrix eines Wundbett um ein intaktes Epithel wiederherzustellen angesehen werden. Neuere Daten legen nahe, dass dieser ex vivo-Kultur imitiert viele Merkmale in vivo Wundheilung bei erwachsenen Zebrafisch. Wundverschlussraten ⁸ zu einer Wanderungsgeschwindigkeit ähnlich zu der in den ex-vivo-System ⁷ beobachtet übersetzen. Zusätzlich wird in einem in vivo-Wundheilungsmodell Behandlung mit Warfarin legt nahe, dass die Hämostase hat keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Heilung, ist während der Behandlung mit Hydrocortison zur Immunantwort verringern nicht Reepithelialisierung ⁸ verzögern </sup>. Da der Zebrafisch blutet nicht, wenn die Waage aus dem Tier entfernt wird, ist die Blutstillung nicht ein wichtiger Akteur. Obwohl wir Immunzellen im Explantate finden, haben wir nicht die Auswirkungen sie auf kollektive Zellmigration haben könnte untersucht.

Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Zebrafisch Keratozyten Explantatkulturen, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit für den Einsatz in vielen biologischen Tests gewährleistet werden kann. Diese Explantatkulturen sind aus mehreren Gründen besonders überzeugende in-vitro-Modell für gemeinsame Zellmigration. Erstens sind die Zebrafisch-Keratozyten Primärzellen innerhalb weniger Stunden nach Gründung Explantatkulturen verwendet. Deshalb wurden diese Zellen nicht die morphologischen Veränderungen der Genexpression und mit dem Durchgang von primären Zellen assoziiert ^9-13 unterzogen. Zweitens, stellt dieses System ein Modell für die Untersuchung der Reepithelialisierung in Antwort auf Verwundung ¹⁴ und, als Teil der Antwort auf Verwundung eines epithelialen mesenchymale transition Prozess (EMT) initiiert wird, wie Veränderungen in der Genexpression und der Umordnung des Cytoskeletts ^14,15 belegt. Somit ändert sich der Hintergrund in der Genexpression und der Beweglichkeit, die in unbehandelten Zellen auftreten wurden charakterisiert und einen Rahmen, um Änderungen bei der Behandlung zu interpretieren. Darüber hinaus die Fische Keratozyten und die menschliche Keratinozyten sind funktionell gleichwertig; beide sind die primären Epithelzellen der jeweiligen Arten und spielen eine Schlüsselrolle in epithelialen Wundheilung. Drittens erwachsenen Zebrafisch werden zunehmend Anerkennung als ein Modellsystem für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen ^16-18 einschließlich Melanomen und anderen Krebs ^19-21, kutane Wundheilung ^8,14 und Geweberegeneration ^22-24.

Technische Vorteile dieses Modellsystems sind gleichermaßen überzeugend. Eine wachsende Zahl von Mutanten und transgenen Linien sind von Non-Profit, zentrale Einrichtungen. Insbesondere wird das Zebrafisch-Mutation Project (ZMP) Am Wellcome Trust Sanger Institute zielt darauf ab, einen KO-Allel in jedem Protein kodierenden Gens im Zebrafisch-Genom zu schaffen. Derzeit haben sie 11.892 Gene, etwa 45% des Genoms mutiert, mit 24.088-Allele aufweist. Darüber hinaus übernimmt ZMP Vorschläge und Knock-outs kostenlos zu generieren. Neue Methoden der Gen-Knockdown in Larven und erwachsenen Zebrafisch ^25-28 bieten Flexibilität, um die Funktion von entwicklungspolitisch wichtige Gene für die transgene Ansätze problematisch oder unmöglich zu studieren.

Durch ihre extrem schnelle Raten von Motilität von ~ 145 um / h kurz nach Gründung der Kulturen ²⁹ können Assays schnell (in der Regel in 24 Stunden oder weniger) durchgeführt werden. Wie Versuche kann schnell abgeschlossen werden und Kulturen wachsen gut bei RT mehrere der technischen Hürden mit Säugerzellmigration Assays, die Videomikroskopie vermieden verbunden. Außerdem im Zeitalter der Anzugsforschungsbudgets, zebrafish sind einfach und kostengünstig gepflegt.

Die Struktur und das Verhalten der Explantation ist komplex. Da die Fische nicht ausbluten, wenn die Waage entfernt wird, ist es unwahrscheinlich, dass viel mehr als die oberflächlichen Schichten der Epidermis mit der Waage entfernt. Keratozyten scheinen die vorherrschende Zelltyp in dem Explantat, wenn Skalen werden zunächst aus dem Fisch entfernt, da die große Mehrheit der Zellen scheinen mit einem Anti-E-Cadherin-Antikörper ¹⁴ zu färben. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise auf Fibroblasten in der Vorkultur wie durch die Abwesenheit von Vimentin Färbung beurteilt durch Immunofluoreszenz ^14. Aber mit wiederholter Steinentfernung scheint es zahlreiche Neutrophile in der Explantation (siehe Video 1). Wir haben diese Zellen wie Neutrophile, basierend auf morphologischen Beobachtungen ihrer Größe schnell Motilität und ihre Migration aus der Zelle ausgewiesenen, wenn sie LPS ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt). Zusätzlich werden diese Zellen zu färben hell Witzh ein Antikörper gegen Neutrophilen cytosolischen Faktor sowie mit einer Vielzahl von sekundären IgG-Antikörper, was darauf hinweist, dass sie reichlich FcRs auf ihrer Oberfläche haben (Daten nicht gezeigt). Mehrere Zellschichten sind in der Explantation vorhanden. Konfokale Mikroskopie zeigt die Anwesenheit einer einzigen Schicht in der Nähe der Vorderkante, um mehr als zwei Schichten von Keratozyten nahe der Skala mit Neutrophilen sichtbar oberhalb, unterhalb und zwischen den Zellen Keratozyten Blättern.

Zu frühen Zeitpunkten, Zellen auf dem Rand des mehrschichtigen Explantat polarisieren, Initiieren kollektiven Migration Keratozyten aus dem Explantat mit anfänglichen Geschwindigkeiten von ~ 145 & mgr; m / h beträgt. Das von dem Explantat abgedeckt schnell zunimmt, was zu Zellausbreitung, Spannung in dem Blatt, und eine verringerte Vorschubgeschwindigkeit von der Vorderkante. Rapid Umwandlungen zwischen führenden und folgenden Zellen werden an der Vorderkante während der Bildung und der Schließung von spontan gebildeten Löcher in der Folie ⁷ beobachtet. Wie dieEMT-Prozess mit dem Explantat initiiert weiterhin die Blattfragmente und die Keratozyten verlieren ihre spezielle, schnelle Beweglichkeit. Genexpression und morphologischen Veränderungen, die mit EMT, Wundheilung, und Entzündungsreaktionen auftreten, innerhalb von 7 Tagen Kultur mit Explantaten erwogen fähig ca. 10 Tage ^14.

Protocol

Dieses Protokoll entspricht den AVMA Tierschutzgrundsätze für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an Midwestern University zugelassen. 1. Vorbereitung der Anästhesie, Ausstattung, & Medien Entchloren ca. 1,5 l Leitungswasser entweder mit einem kommerziellen Entchlorungsmittel (erhältlich in Zoohandlungen) oder durch stehendes Wasser für 24 Stunden. Wenn Sie drei 1 l Becher und füllen jeweil…

Representative Results

Wie in Figur 1 dargestellt ist, können Blätter von Keratozyten Migration aus unter der Skala innerhalb von Stunden nach Errichtung der Explantatkultur beachten. Gelegentlich kann ein individuell Migration Keratozyten, die aus dem gemeinsam Migration Blatt weggebrochen wurde, einzuhalten ist. Zusätzlich, da das Explantat von einem Fisch, der zuvor gezupft worden hergestellt ist, gibt es reichlich Neutrophilen migrieren durch die Folie. Bei längeren Kulturzeiträume, die Keratozyten Blatt Fragmente al…

Discussion

Der entscheidende Schritt für den Erfolg der Keratozyten Explantatkultur wird kann die Waage in die Kulturschale für etwa 2 haften – 3 Minuten vor der Zugabe von dem Kulturmedium. Etwa 75% der Schuppen haften und wachsen Blätter (die Anzahl der Kulturen für jedes Experiment etabliert müssen entsprechend angepasst werden). Keratozyten Blätter sind nicht an jeder Waage aus dem Fisch herausgenommen und in der Kultur aus verschiedenen Gründen getätigt. Zuerst DAPI-Färbung von Explantaten auf, dass einige Skalen hab…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.