Zebrafish Keratocyte Explants त्वचीय घाव भरने में कलेक्टिव सेल प्रवास और Reepithelialization अध्ययन करने के लिए
Summary
Zebrafish keratocytes explants से सेल शीट में विस्थापित और उपकला घाव भरने के संदर्भ में सामूहिक सेल प्रवास के तंत्र के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल प्रदान करते हैं। इन प्रोटोकॉल विस्तार सामूहिक सेल प्रवास assays में उपयोग के लिए प्राथमिक explant संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक कारगर तरीका है।
Abstract
कारण उनके अद्वितीय गतिशील गुणों के लिए, मछली keratocytes explant संस्कृतियों लंबे एकल सेल प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है से अलग। गतिशीलता का तेजी से दरें, एक सीधा actin के केबल के साथ व्यापक actin के अमीर lamellae, और अपेक्षाकृत स्थिर गति और: explants स्थापित कर रहे हैं हालांकि, जब इन कोशिकाओं को भी अलग-अलग प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल keratocytes बनाने के लिए जो सुविधाओं के कई बनाए रखने, सामूहिक रूप से ले जाने के प्रवास की दिशा। जल्दी explants में, सामूहिक रूप से पलायन कर उन लोगों के साथ व्यक्तिगत रूप से पलायन कोशिकाओं का तेजी से interconversion प्रवास की विधा का निर्धारण करने में सेल सेल adhesions की भूमिका का अध्ययन करने की अनुमति देता है, और प्रवास के दो मोड के बीच आणविक लिंक पर जोर दिया। Mesenchymal संक्रमण के लिए एक उपकला होता है और घाव भरने और सूजन के साथ जुड़े जीन विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं के रूप में बाद में explants में कोशिकाओं के तेजी से और सामूहिक रूप से विस्थापित करने के लिए अपनी क्षमता खो देते हैं। इस प्रकार, keratocyte explants त्वचीय घाव भरने के दौरान होता है और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का एक परिभाषित कार्यक्रम के संदर्भ में सामूहिक सेल प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अनूठी प्रणाली का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि reepithelialization के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं। उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों की एक किस्म उपलब्ध हैं, explants के विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ मछली से स्थापित करने के लिए अनुमति देता है। यह इन प्रक्रियाओं के भीतर विभिन्न प्रोटीन की भूमिका विशिष्ट संबोधित करने की अनुमति देता है। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल सामूहिक सेल प्रवास से संबंधित assays के एक किस्म में इस्तेमाल के लिए इन explant संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक आसान और प्रभावी विधि का वर्णन।
Introduction
सेल गतिशीलता का अध्ययन परंपरागत रूप से व्यक्तिगत रूप से पलायन कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है। मछली और उभयचर explants से सुसंस्कृत Keratocytes 1-6 दृष्टिकोण प्रयोगात्मक और गणितीय दोनों मॉडलिंग का उपयोग करते हुए सेल गतिशीलता के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली साबित किया है। एक समान आकार, गति और दिशा को बनाए रखते हुए व्यक्तिगत रूप से पलायन कोशिकाओं पर प्रयोगात्मक कार्य, कोशिकाओं का तेजी से, चिकनी ग्लाइडिंग गति से सहायता प्राप्त है। विशेष रूप से embryogenesis, घाव भरने, और मेटास्टेसिस के दौरान, सेल सेल जंक्शनों को बनाए रखते हुए हालांकि, विवो में, कोशिकाओं अक्सर सामूहिक रूप से चलते हैं। इस प्रकार, सामूहिक सेल प्रवास सेल प्रवास के क्षेत्र के भीतर अनुसंधान के एक बढ़ रहा है और तेजी से प्रमुख क्षेत्र है। इन कोशिकाओं के सामूहिक प्रवास हाल ही में 7 वर्णित किया गया है और यह एक घाव भरने मॉडल में सामूहिक सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली बनाने के लिए जो कई अद्वितीय विशेषताएं है।
ove_content "> तराजू एक anesthetized वयस्क zebrafish से plucked रहे हैं, कुछ उपकला ऊतक पैमाने के नीचे करने के लिए जुड़ा रहता है। सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जाता है, इन उपकला कोशिकाओं, या keratocytes, पैमाने से एक सामूहिक इकाई के रूप में तेजी से पलायन। explant संस्कृति कोशिकाओं वे एक अक्षुण्ण उपकला पैर जमाने के लिए बिस्तर एक घाव की अनंतिम मैट्रिक्स भर के रूप में होगा explant से दूर विस्थापित जिसमें एक उपकला घाव भरने मॉडल, के रूप में देखा जा सकता है। हाल ही के डेटा से पता चलता है कि इस पूर्व vivo संस्कृति mimics की कई विशेषताएं है कि vivo में वयस्क zebrafish में चिकित्सा घाव। घाव बंद दरों में आठ पूर्व vivo प्रणाली 7 में मनाया समान माइग्रेशन गति के लिए अनुवाद करते हैं। इसके अलावा, एक Vivo में घाव में मॉडल चिकित्सा, वारफ़रिन के साथ इलाज के रक्तस्तम्भन दर पर कोई प्रभाव नहीं है कि पता चलता है hydrocortisone के साथ इलाज के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करने के लिए है, जबकि चिकित्सा की, reepithelialization 8 देरी नहीं करता </> समर्थन। पैमाने जानवर से हटा दिया जाता है जब zebrafish खून बहाना नहीं करता है, रक्तस्तम्भन एक प्रमुख खिलाड़ी नहीं है। हम explants में प्रतिरक्षा कोशिकाओं में पाया गया है, हम वे सामूहिक सेल प्रवास पर हो सकता है प्रभाव का अध्ययन नहीं किया है।यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कई जैविक assays में उपयोग के लिए स्थिरता और reproducibility सुनिश्चित है कि zebrafish keratocyte explant संस्कृतियों स्थापित करने के लिए कैसे करें। ये explant संस्कृतियों कई कारणों के लिए सामूहिक सेल प्रवास के लिए इन विट्रो मॉडल में एक विशेष रूप से मजबूर कर रहे हैं। सबसे पहले, zebrafish keratocytes explant संस्कृतियों की स्थापना के घंटे के भीतर इस्तेमाल किया प्राथमिक कोशिकाओं रहे हैं। इसलिए, इन कोशिकाओं प्राथमिक कोशिकाओं 9-13 के पारित होने के साथ जुड़े रूपात्मक और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं आया है। दूसरा, इस प्रणाली लोग घायल हो गए के जवाब, mesenchymal tr के लिए एक उपकला के हिस्से के रूप में, 14 लोग घायल हो गए के जवाब में reepithelialization के अध्ययन के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है औरजीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और cytoskeletal rearrangements 14,15 इसका सबूत के रूप ansition (EMT) की प्रक्रिया शुरू की है। इस प्रकार, अनुपचारित कोशिकाओं में पाए जाते हैं, जो जीन अभिव्यक्ति और गतिशीलता में पृष्ठभूमि में परिवर्तन की विशेषता और उपचार के साथ परिवर्तन की व्याख्या करने के लिए एक संदर्भ प्रदान किया गया है। इसके अलावा, मछली keratocyte और मानव keratinocyte कार्यात्मक समकक्ष हैं; दोनों अपने-अपने प्रजातियों के प्राथमिक उपकला कोशिकाओं रहे हैं और उपकला घाव भरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। तीसरा, वयस्क zebrafish मेलेनोमा और अन्य कैंसर 19-21, 8,14 और ऊतक पुनर्जनन 22-24 चिकित्सा त्वचीय घाव सहित मानव रोगों 16-18 की एक किस्म के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मान्यता प्राप्त कर रहे हैं।
इस मॉडल प्रणाली की तकनीकी फायदे समान रूप से बाध्यकारी हैं। उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक लाइनों की बढ़ती संख्या गैर लाभ, केंद्रीकृत सुविधाओं से उपलब्ध हैं। विशेष रूप से, zebrafish म्यूटेशन परियोजना (ZMP) वेलकम ट्रस्ट सेंगर इंस्टीट्यूट में zebrafish जीनोम में जीन कोडिंग हर प्रोटीन में एक पीटा एलील बनाने के लिए करना है। वर्तमान में, वे विशेषता 24,088 alleles के साथ, 11,892 जीन, जीनोम का लगभग 45% उत्परिवर्तित। इसके अलावा, ZMP प्रस्तावों को स्वीकार करता है और नि: शुल्क दस्तक बहिष्कार उत्पन्न होगा। लार्वा और वयस्क zebrafish 25-28 में जीन पछाड़ना में हाल के तरीकों ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण समस्याग्रस्त या अव्यावहारिक है, जिसके लिए विकासात्मक महत्वपूर्ण जीनों के समारोह का अध्ययन करने के लिए लचीलापन प्रदान करते हैं।
~ 145 माइक्रोन / घंटा की गतिशीलता की उनकी बहुत तेजी दरों की वजह से शीघ्र ही संस्कृतियों 29 की स्थापना के बाद, assays के (आमतौर पर 24 घंटे या उससे कम समय में) तेजी से पूरा किया जा सकता है। प्रयोगों तेजी से पूरा किया और संस्कृतियों, आरटी पर अच्छी तरह से वीडियो माइक्रोस्कोपी शामिल स्तनधारी सेल प्रवास assays के परहेज कर रहे हैं के साथ जुड़े तकनीकी बाधाओं के कई बढ़ने जा सकता है। इसके अलावा, अनुसंधान बजट कस साल की उम्र में, zebrafish आसानी से और सस्ते में रखा जाता है।
explant के संरचना और व्यवहार जटिल है। पैमाने हटा दिया जाता है जब मछली खून बहाना नहीं है, यह सतही एपिडर्मल परतों की तुलना में बहुत अधिक पैमाने के साथ हटा रहे हैं कि संभावना नहीं है। कोशिकाओं के विशाल बहुमत के लिए एक विरोधी ई cadherin एंटीबॉडी 14 के साथ दाग दिखाई देते हैं के रूप में तराजू शुरू में मछली से हटा रहे हैं जब Keratocytes explant में प्रमुख सेल प्रकार दिखाई देते हैं। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस 14 से vimentin धुंधला की अनुपस्थिति से न्याय के रूप में प्रारंभिक संस्कृति में fibroblasts की कोई सबूत नहीं है। हालांकि, दोहराया पैमाने हटाने के साथ, explant में कई न्यूट्रोफिल होने के लिए वहाँ दिखाई देते हैं (1 वीडियो देखें)। LPS उजागर करने के लिए जब हम उनके आकार, तेजी से गतिशीलता, और सेल चादर के बाहर उनके प्रवास के रूपात्मक टिप्पणियों पर आधारित न्यूट्रोफिल के रूप में इन कोशिकाओं की पहचान की है (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अतिरिक्त, इन कोशिकाओं चमकते बुद्धि दागन्युट्रोफिल साइटोसोलिक कारक के रूप में अच्छी तरह से वे अपनी सतह पर प्रचुर मात्रा में FcRs इंगित करता है कि जो माध्यमिक आईजीजी की एक किस्म के लिए एक एंटीबॉडी (नहीं दिखाया डेटा) एच। कई सेल परतों explant के भीतर मौजूद हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी से ऊपर, नीचे, और सेल keratocyte चादर के बीच दिखाई दे न्यूट्रोफिल के साथ पैमाने पास keratocytes के दो से अधिक परतों के लिए अग्रणी किनारे के पास एक परत की उपस्थिति का पता चलता है।
जल्दी समय बिंदुओं पर, ~ 145 माइक्रोन / घंटा की प्रारंभिक दरों पर explant से keratocytes के सामूहिक प्रवास की शुरुआत बहु परत explant फूट डालना के किनारे, पर कोशिकाओं। explant द्वारा कवर क्षेत्र में तेजी से बढ़ जाती है, चादर के भीतर, तनाव प्रसार सेल करने के लिए अग्रणी है, और अग्रणी धार के अग्रिम की एक कम दर है। नेता और अनुयायी कोशिकाओं के बीच रैपिड interconversions चादर 7 भीतर अनायास गठन छेद के गठन और बंद के दौरान अग्रणी धार पर मनाया जाता है। जैसाExplant के साथ शुरू की EMT प्रक्रिया चादर के टुकड़े और keratocytes उनके विशेष, तेजी से गतिशीलता खो, जारी है। जीन की अभिव्यक्ति और EMT के साथ संगत morphological परिवर्तन, घाव भरने, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं explants के लगभग 10 दिनों में 14 के लिए व्यवहार्य माना जा रहा है के साथ संस्कृति के 7 दिनों के भीतर होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति के माध्यम के अलावा पहले 3 मिनट – keratocyte explant संस्कृति की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम पैमाने लगभग 2 के लिए संस्कृति डिश का पालन करने की अनुमति है। लगभग तराजू के 75% पालन करना और (एक प्रयोग के लिए स्थ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के अनुसंधान सुविधा अनुदान EEH और रिसर्च के मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय कार्यालय और अंदर का अनुदान KJL सम्मानित करने के लिए प्रायोजित कार्यक्रमों के लिए सम्मानित किया स्वास्थ्य विज्ञान के मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय कॉलेज से धन के द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
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