Zebrafisk Keratocyte Explants att studera Kollektiv Cell Migration och reepithelialization i Kutan sårläkning

Summary

Zebrafisk keratocyter migrera i cellblad från explantat och ge en modell för att studera mekanismerna för kollektiv migrationscell i samband med epitel sårläkning in vitro. Dessa protokoll detalj ett effektivt sätt att etablera primära Explantation kulturer för användning i kollektiva analyser cellmigrations.

Abstract

På grund av sina unika rörliga egenskaper, dissocierade fisk keratocyter från Explantation kulturer har länge använts för att studera mekanismerna för enskild cell migration. Men när explantaten är etablerade, dessa celler flytta också kollektivt, bibehålla många av de egenskaper som gör individen keratocyter en attraktiv modell för att studera migration: snabba priser av motilitet, omfattande aktin rika lameller med en vinkelrät aktin kabel, och relativt konstant hastighet och riktningen migration. I tidiga explants, den snabba omvandling av celler migrerar individuellt med de som migrerar tillsammans möjliggör studier av den roll som cell-cell sammanväxningar att bestämma läget för migration, och betonar de molekylära sambanden mellan de två lägena av migration. Celler i senare explants förlorar sin förmåga att migrera snabbt och kollektivt som en epitelial till mesenkymala övergång sker och gener associerade med sårläkning och inflammation är differentiellt uttryckta. Sålunda kan keratocyte explantat tjäna som en modell för reepithelialization som sker under kutan sårläkning och kan representera ett unikt system för att studera mekanismer för kollektiv migrationscell inom ramen för ett definierat program av genexpressionsförändringar in vitro. En mängd olika muterade och transgena zebrafisk linjer finns tillgängliga, vilket gör att explants skall fastställas från fisk med olika genetisk bakgrund. Detta gör att betydelsen av olika proteiner inom dessa processer att entydigt åtgärdas. De protokoll som beskrivs här beskriva en enkel och effektiv metod för att fastställa dessa Explantation kulturer för användning i en mängd olika analyser som rör kollektiv migration cell.

Introduction

Studier av cellrörlighet har traditionellt fokuserat på individuellt migrerande celler. Keratocyter odlade från fisk och amfibie explants har visat sig vara ett kraftfullt modellsystem för att studera mekanismerna för cellmotilitet med både experimentell och matematisk modellering ^1-6. Experimentellt arbete på individuellt migrerande celler underlättas av den snabba, smidigt glid rörelse av cellerna, och samtidigt bibehålla en enhetlig form, hastighet och riktning. Men in vivo, celler flytta ofta kollektivt bibehållen cell-cell korsningar, särskilt under embryogenes, sårläkning, och metastasering. Således är kollektiv migration cell en växande och alltmer framträdande forskningsområde inom området cellmigration. Den kollektiva migrering av dessa celler har nyligen beskrivits ⁷ och det har många unika egenskaper som gör det till ett kraftfullt system för att studera kollektiva migration cell i en sårläkning modell.

ove_content "> När skalor är plockade från en sövd vuxen zebrafisk, förblir en del epitelvävnad monteras på undersidan av skalan. När cellkulturmedium läggs, dessa epitelceller, eller keratocyter, migrera snabbt som en kollektiv enhet från skalan. Den Explantation kulturen kan ses som en epitelial sårläkning modell, där cellerna migrera bort från explantatet som de skulle över provisoriska matris av ett sår säng att återupprätta en intakt epitel. Nya uppgifter tyder på att detta ex vivo kultur härmar många funktioner i in vivo sårläkning i vuxen zebrafisk. sårtillslutning hastigheter ⁸ översätta till en migrationshastighet liknande den som observerades i den ex vivo systemet ^7. Dessutom, i en in vivo sårläknings modell, föreslår behandling med warfarin att hemostas har någon effekt på hastighet av healing, medan behandling med hydrokortison för att minska immunsvaret inte försena reepithelialization ⁸ </sup>. Som zebrafisk inte blöder när vågen tas bort från djuret, är hemostas inte en stor aktör. Även om vi har hittat immunceller i explantat har vi inte studerat de effekter de kan ha på kollektiv migration cell.

Protokollet presenteras här beskriver hur man kan upprätta zebrafisk keratocyte Explantation kulturer som säkerställer konsekvens och reproducerbarhet för användning i många biologiska analyser. Dessa Explantation kulturer är en särskilt övertygande in vitro modell för kollektiv migration cell av flera skäl. Först, zebrafisk keratocyter är primära celler som används inom timmar av upprättandet Explantation kulturer. Därför har dessa celler inte genomgått de morfologiska och genuttryck förändringar i samband med passage av primära celler ^9-13. För det andra, innebär detta system en modell för studier av reepithelialization som svar på såra ¹⁴ och, som en del av svaret på såra, en epitelial till mesenkymala transition (EMT) initieras, vilket framgår av förändringar i genuttryck och cytoskelettala omdisponeringar ^14,15. Sålunda har den bakgrunden förändringar i genuttryck och motilitet vilka uppträder i obehandlade celler karakteriserats och ger ett sammanhang för att tolka förändringar med behandling. Dessutom fisken keratocyte och mänskliga keratinocyte är funktionellt likvärdiga; båda är de primära epitelceller i deras respektive art och spela en nyckelroll i epitelial sårläkning. Tredje, vuxen zebrafisk vinner erkännande som ett modellsystem för en mängd olika mänskliga sjukdomar ^16-18 inklusive melanom och andra cancerformer ^19-21, kutan sårläkning ^8,14 och vävnadsregenerering ^22-24.

Tekniska fördelar för detta modellsystem är lika övertygande. Ett växande antal muterade och transgena linjer finns tillgängliga från ideell, centraliserade anläggningar. Specifikt Zebrafish Mutation Project (ZMP) Vid Wellcome Trust Sanger Institute syftar till att skapa en knockout allel i varje proteinkodande genen i zebrafisk genomet. För närvarande har de muterade 11892 gener, cirka 45% av genomet, med 24088 alleler karakteriserade. Dessutom accepterar ZMP förslag och kommer att generera knock-outs gratis. Nya metoder i gen knockdown i larv och vuxna zebrafisk ^25-28 ger flexibilitet för att studera funktionen av utvecklingsmässigt viktiga gener som transgena metoder är problematiska eller opraktiskt.

På grund av deras extremt snabba hastigheter av motilitet ~ 145 nm / hr strax efter etablering av kulturer ^29, kan analyser slutföras skyndsamt (vanligtvis i 24 timmar eller mindre). Som experiment kan genomföras snabbt och kulturer växer bra vid RT, flera av de tekniska hinder som är förknippade med däggdjurscellmigrations analyser involverande videomikroskopi undviks. Dessutom i en ålder av åtstramning forskningsbudgetar, zebrafish är enkelt och billigt underhålls.

Strukturen och beteende explantatet är komplex. Eftersom fisken inte blöder när vågen tas bort, är det osannolikt att mycket mer än de ytliga epidermala lagren avlägsnas med skalan. Keratocyter verkar vara den dominerande celltypen i explantatet när skalor initialt avlägsnas från fisken som de allra flesta celler verkar för att färga med en anti-E-cadherin antikropp ^14. Dessutom finns det inga bevis för fibroblaster i det ursprungliga kulturen som bedöms av frånvaron av vimentin färgning genom immunofluorescens ^14. Men med upprepad skala bort, det verkar vara många neutrofiler i explantatet (se video 1). Vi har identifierat dessa celler som neutrofiler baserade på morfologiska observationer av deras storlek, snabbt motilitet, och deras migrering ut ur cellen bladet när den utsätts för LPS (data visas ej). Dessutom dessa cellerna färgas ljust with en antikropp mot neutrofil cytosoliskt faktor samt med en mängd sekundära IgG-antikroppar, vilket tyder på att de har rikliga FcR på sin yta (data visas ej). Flera cellskikt är närvarande inom Explantation. Konfokalmikroskopi avslöjar närvaron av ett enda lager nära framkanten till mer än två lager av keratocyter nära skalan med neutrofiler synliga ovanför, under och mellan cell keratocyte arken.

Vid tidiga tidpunkter, celler på kanten av den flerskiktiga explantatet polariserar, initiera kollektiv migration av keratocyter från explantatet vid initiala hastigheter av ~ 145 | im / h. Det område som täcks av explantatet snabbt ökar, vilket leder till cellspridning, spänningar inom arket, och en minskad framflyttningshastighet av framkanten. Snabba omvandlingar mellan ledare och efterföljare celler observeras vid framkanten under bildandet och nedläggning av spontant formade hål i arket ^7. SomEMT process som inleddes med Explantation fortsätter, fragmenten ark och keratocyter förlorar sin specialiserade, snabb motilitet. Genuttryck och morfologiska förändringar som överensstämmer med EMT, sårläkning och inflammatoriska svar inträffar inom 7 dagar efter kultur med explantat vägs lönsamt för ungefär 10 dagar ^14.

Protocol

Detta protokoll uppfyller AVMA Animal Welfare Principer för vård och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Midwestern University. 1. Beredning av anestesi, utrustning, & Media Deklorera approximativt 1,5 L av kranvatten med användning av antingen en kommersiell dechlorinating medel (finns på djuraffärer) eller genom att låta vattnet stå i 24 h. Skaffa tre 1 L bägare och fyll med vardera 500 ml…

Representative Results

Som visas i figur 1, kan observeras ark keratocyter migrera ut underifrån skalan inom timmar upprättandet explantatet kulturen. Ibland kan observeras en individuellt migrera keratocyte som har brutit sig loss från den kollektivt migrera arket. Dessutom, eftersom explantatet etablerades från en fisk som tidigare hade plockat, det finns rikligt neutrofiler migrerar genom arket. Vid längre odlingsperioder, de keratocyte plåtfragment som celler genomgår EMT 14. …

Discussion

Det mest kritiska steget för framgång keratocyte Explantation kulturen tillåter skalan att hålla sig till kulturen skålen för cirka 2-3 minuter före tillsats av odlingsmediet. Cirka 75% av skalor kommer att fästa och växa blad (antalet kulturer som fastställts för varje experiment kommer att behöva justeras därefter). Keratocyte ark bildar inte runt varje skala avlägsnas från fisken och placerades i odling av flera skäl. Först DAPI färgning av explantat visar att vissa skalor har få celler fästa och …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.