Zebra balığı Keratosit Eksplantlarındaki Deri Yara İyileşmesi Toplu Hücre Göç ve reepithelialization Eğitim için
Summary
Balığı keratositler eksplantlardan hücre tabakaları hareket eder ve epitel yara iyileşmesi bağlamında toplu hücre göçü mekanizmaları üzerinde çalışılması için bir in vitro model sağlar. Bu protokoller detaylı toplu hücre göçü tahlillerde kullanılmak için primer eksplant kültürleri oluşturmak için etkili bir yoldur.
Abstract
Dolayı eşsiz hareketli özellikleri, balık keratositler eksplant kültürleri, uzun tek hücre göçü mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır ayrışmış. Motilite hızlı oranları, bir dik aktin kablosu ile geniş aktin-zengin lamel, ve nispeten sabit hız ve: eksplant kurulmuş Ancak, bu hücreler de bireysel göç incelemek için cazip bir model keratositler yapmak birçok özellikleri koruyarak, topluca hareket göç yönü. Erken eksplantlarda, toplu göç edenlerin ayrı ayrı göç hücrelerin hızlı bir ara-geçiş modunu belirlenmesinde hücre-hücre yapışıklıklar rolü çalışma sağlar, ve göç iki mod arasında moleküler bağları vurgulamaktadır. Mezenkimal geçiş bir epitel oluşur ve yara iyileşmesi ve enflamasyon ile ilişkili genlerin farklı ifade olarak daha sonraki eksplantlarda Hücreler hızla ve toplu göç etme yeteneklerini kaybederler. Bu nedenle, keratosit eksplantlar deri yara iyileşmesi sırasında görülen ve gen sentezleme değişikliklerin belirli bir programı kapsamında toplu hücre göçü mekanizmaları incelemek için benzersiz bir sistemi temsil edebilir reepithelialization için bir in vitro model olarak hizmet edebilir. Mutant ve transgenik zebra balığı hatlarının çeşitli mevcuttur eksplantlar, farklı genetik geçmişlerde, balık tesis edilmesi için izin verilmiştir. Bu durum, bu süreçler içinde farklı protein rolü benzersiz tepki verebilir. Burada belirtilen protokoller toplu hücre göçü ile ilgili bir çok analizde kullanım için olan bu eksplant kültürleri oluşturulması için kolay ve etkili bir yöntem tarif eder.
Introduction
Hücre hareketi Çalışmaları geleneksel bireysel göç hücreleri üzerinde odaklanmıştır. Balık ve amfibi Eksplantlardan kültürlü keratositler 1-6 yaklaşımları deneysel ve matematiksel modelleme hem de kullanılarak hücre hareketi mekanizmaları incelemek için güçlü bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Düzgün bir şekil, hız, yön ve korurken bireysel göç hücreleri üzerinde deneysel çalışmalar, hücrelerin hızlı, pürüzsüz kayma hareketi ile destekli olduğunu. Özellikle embriyojenez, yara iyileşmesi, ve metastaz sırasında, hücre-hücre kavşaklar muhafaza Bununla birlikte, in vivo koşullarında, hücreler sık sık birlikte hareket eder. Böylece, toplu hücre göçü, hücre göçü alanında araştırma büyüyen ve giderek daha belirgin bir alandır. Bu hücrelerin toplu göç son zamanlarda 7 tarif edilmiştir ve bunun bir yara iyileşmesi modelinde toplu hücre göçü çalışmak için güçlü bir sistem yapmak birçok benzersiz özelliklere sahiptir.
ove_content "> terazi Anestezi uygulanmış yetişkin bir zebrabalıkları koparılan zaman, bir epitel doku ölçek alt bağlı kalır. hücre kültür ortamı eklenir, bu epitel hücreleri veya keratositler, ölçekli bir toplu birim olarak daha hızlı göç ederler. The, eksplant kültürü hücreleri sağlam bir epitel yeniden kurmak için yatağı bir yaranın geçici matris boyunca olduğu gibi eksplant uzak göç olduğu bir epitel yara iyileşmesi modeli olarak görülebilir. Son veriler göstermektedir bu ex vivo kültür taklit birçok özellikleri olduğunu in vivo yetişkin zebrafish yaranın iyileşmesini. Yara kapatma oranları 8 ex vivo sistemde 7 gözlenen benzer bir göç hızına çevirmek. Ayrıca, bir in vivo yara iyileşme modeli, warfarin ile tedavi hemostaz oranı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir hidrokortizon tedavisi bağışıklık yanıtı azaltmak için ise şifa, reepithelialization 8 gecikme değil </> sup. Ölçek hayvan çıkarıldığında Zebra balığı kanama değil gibi, hemostaz önemli bir oyuncu değil. Biz eksplantlarda bağışıklık hücrelerini bulduk rağmen, biz onlar kolektif hücre göçü üzerinde olabilir etkileri incelenmiştir değil.Burada sunulan protokol birçok biyolojik tahlillerde kullanılmak için tutarlılık ve yeniden üretilebilirlik sağlamak zebra balığı keratosit eksplant kültürleri oluşturulması anlatılmaktadır. Bu eksplant kültürler çeşitli nedenlerle toplu hücre göçü için in vitro model özellikle zorlayıcı. İlk olarak, zebra balığı keratositler eksplant kültürleri oluşturulması saat içinde kullanılan primer hücrelerdir. Bu nedenle, bu hücreler, birincil hücrelerin 9-13 geçişi ile ilişkili morfolojik ve gen ifadesi değişikliklerini geçirmiş değil. İkinci olarak, bu sistem, yaralanma karşısında, mezenkimal tr bir epitel bir parçası olarak, 14 yaralama yanıt olarak reepithelialization çalışma için bir modeli temsil eder vegen ekspresyonunda değişiklikler ve sitoskeletal yeniden düzenlemeler 14,15 ile kanıtlandığı gibi ansition (EMT) işlemi başlatılır. Böylece, işlenmemiş hücrelerde meydana gen ifadesi ve hareketlilik arka plan değişiklikleri ile karakterize ve tedavi değişiklikleri yorumlamak için bir bağlam sağlamak edilmiştir. Ayrıca, balık keratosit ve insan keratinosit işlevsel olarak eşdeğer olan; her ikisi de kendi türlerinin birincil epitelyum hücreleri ve epitel yara iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Üçüncü olarak, yetişkin zebrabalıkları melanom ve diğer kanserler 19-21, 8,14 ve doku rejenerasyonu 22-24 iyileşme deri yara dahil olmak üzere insan hastalıklarının 16-18 çeşitli için bir model sistem olarak tanıma kazanıyor.
Bu model, sistemin teknik avantajları eşit zorlayıcı. Mutant ve transgenik hatları giderek artan sayıda kar amacı gütmeyen, merkezi tesisleri mevcuttur. Özellikle, Zebra balığı Mutasyon Projesi (SMN) Wellcome Trust Sanger Enstitüsü Zebra balığı genomunda geni kodlama her protein bir nakavt alel yaratmayı amaçlamaktadır. Şu anda, bu özelliği, 24.088 allel ile, 11892 gen, genomun yaklaşık olarak% 45 mutasyona uğramış. Buna ek olarak, SMN önerilerini kabul ve ücretsiz knock-çıkışları üretecektir. Larva ve ergin zebrabalıkları 25-28 gen demonte son yöntemler transgenik yaklaşımlar sorunlu ya da pratik olduğu için gelişimsel olarak önemli genlerin fonksiyonunu incelemek için esneklik sağlar.
~ 145 mm / saat motilite onların son derece hızlı oranları nedeniyle kısa bir süre kültürlerin 29 kurulmasından sonra, tahliller (genellikle 24 saat ya da daha az) hızla tamamlanabilir. Deneyler hızla tamamlandı ve kültürler, oda sıcaklığında iyi bir video mikroskobu ile ilgili memeli hücre göçü tahlilleri önlenir ile ilgili teknik engeller birkaç büyümesi gibi. Buna ek olarak, araştırma bütçeleri sıkma çağında, zebrafish kolay ve masrafsız korunur.
eksplant yapısı ve davranışları karmaşık. Ölçek çıkarıldığında balık kanama yok gibi, yüzeysel epidermal katmanlar daha fazla ölçek ile kaldırılır olası değildir. Hücrelerinin büyük bir çoğunluğu, bir anti-E-kaderin antikoru 14 leke görüldüğünden ölçekler ilk balık kaldırıldığında keratosit eksplant baskın hücre tipi olduğu görülmektedir. Ayrıca, bağışıklık 14 vimentin boyanma olmaması ile değerlendirildiği gibi, ilk kültür fibroblastların bir kanıt yoktur. Ancak, tekrarlanan ölçekli kaldırılması ile, eksplant sayısız nötrofiller olduğu görülmektedir (Videoyu 1). LPS'ye maruz Biz, büyüklükleri, hızlı bir şekilde hareketliliği ve hücre zarının dışına göçlerine morfolojik gözlemlerine dayanarak nötrofiller gibi bu hücreleri belirledik (veriler gösterilmemiştir). Buna ek olarak, bu hücreler, parlak wit lekenötrofil sitosolik faktörü gibi olan kendi yüzeyi üzerinde bol FcR'yi olduğunu gösterir ikincil IgG antikorları, çeşitli için bir antikor (veriler gösterilmemiştir) h. Çoklu hücre tabakaları eksplant içinde mevcut. Konfokal mikroskopi altında, üstünde, ve hücre keratosit levhalar arasındaki görünür nötrofiller ölçeğin yanında keratositlerin ikiden daha fazla katman için öncü kenarında tek bir tabaka mevcudiyetini ortaya koymaktadır.
Erken zaman noktalarında, ~ 145 mm / saat başlangıç fiyatla eksplantından keratositlerin toplu göç başlatan çok katmanlı eksplant polarize kenarında hücreler. Eksplant tarafından kaplanan alan hızla artar tabaka içinde, gerilim yayılan hücreye giden ve ön kenarın önceden bir azalma oranı. Lider ve takipçi hücreleri arasındaki hızlı dönüşümleri tabaka 7 içinde kendiliğinden oluşan deliklerin oluşumu ve kapatılması sırasında önde gelen kenarında görülmektedir. OlarakEksplant ile başlatılan EMT süreç sac parçaları ve keratositler kendi uzmanlık, hızlı hareketliliği kaybetmek, devam ediyor. Gen ifadesi ve EMT ile uyumlu morfolojik değişiklikler, yara iyileşmesi ve inflamatuar yanıtlar eksplant yaklaşık 10 gün 14 için geçerli kabul ediliyor kültür 7 gün içinde ortaya çıkar.
Protocol
Representative Results
Discussion
kültür ortamı ilavesinden önce 3 dk – keratosit eksplant kültürünün başarısı için en kritik adım ölçeği yaklaşık 2 için kültür çanak uymak için izin veriyor. Yaklaşık ölçek% 75 yapışır ve (her bir deney için kurulan kültürlerin sayısı buna göre ayarlanması gerekir) yaprak artacak. Keratosit yaprak balık çıkarıldı ve çeşitli nedenlerle kültüre yerleştirilmiştir, her ölçek çevresinde oluşturmazlar. İlk olarak, eksplant DAPI boyama bazı ölçekler birkaç hücre bağlı…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Araştırma Kolaylaştırma Hibe EEH ve Araştırma Ortabatı Üniversitesi Ofisi ve Intramural Hibe KJL verilen Sponsor Programlar verilen Sağlık Bilimleri Ortabatı University College fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
Riferimenti
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture – primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
